橙色大白菜同核異質(zhì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的分子鑒定與園藝性狀比較

王若凡 馬 帥 陳 霖 盧倩倩 孟 艷 張魯剛

（旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinesis（Lour）Olsson〕是我國廣泛栽培和食用的十字花科蔬菜之一，具有非常明顯的雜種優(yōu)勢。目前，大白菜雜交種制種主要是利用自交不親和系和雄性不育兩用系，但這兩種制種方法存在著雜交率低和制種麻煩的弊端。利用胞質(zhì)雄性不育系制種是作物雜種優(yōu)勢利用最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，因此大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育成為生產(chǎn)上迫切需要解決的問題。

大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育主要分為大白菜波里馬甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Pol CMS）和蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Ogu CMS）兩種類型。細(xì)胞質(zhì)雄性不育性是由細(xì)胞核不育基因與細(xì)胞質(zhì)不育基因互作、共同控制的不能產(chǎn)生有活力花粉的母性遺傳性狀（徐一蘭 等，2006）。研究表明，orf138、orf222、orf224分別為Ogu 型蘿卜、Nap 型甘藍(lán)型油菜、Pol 型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育類型的細(xì)胞質(zhì)基因（萬正杰 等，2006）。

在大白菜Pol CMS 的相關(guān)研究中，柯桂蘭等（1992）用大白菜3411-7 為父本轉(zhuǎn)育Pol CMS，最終獲得了大白菜胞質(zhì)雄性不育系CMS3411-7。楊曉云等（2006）以不結(jié)球白菜Pol CMS 為不育源，用大白菜自交系作轉(zhuǎn)育父本，通過雜交、多代回交及不育性選擇，育成穩(wěn)定性強(qiáng)、耐低溫的大白菜Pol CMS 不育系A(chǔ)7，并且已經(jīng)用于雜交種配制。但Pol CMS 在偏低溫度條件下常產(chǎn)生少量花粉，從而影響雜交種的純度。Ogu CMS 的研究雖然取得了很大進(jìn)展，但還存在隨著轉(zhuǎn)育代數(shù)增加材料出現(xiàn)退化等問題亟需解決，因此該不育系未能廣泛用于生產(chǎn)之中（崔冰 等，2018）。此外，張德雙等（2002）從法國引進(jìn)了甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料CMS96，經(jīng)過多代回交轉(zhuǎn)育，成功地轉(zhuǎn)育出5 份不同類型的大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，這些不育系材料不育性穩(wěn)定，具有較高的利用價值。

本試驗在前人研究基礎(chǔ)上，以西北農(nóng)林科技大學(xué)大白菜課題組選育的優(yōu)良橙色大白菜自交系15S1094 及其同核異質(zhì)不育系18C5、18C6 為研究對象，對保持系和不育系的植株性狀、花器形態(tài)等進(jìn)行觀測、比較，鑒定細(xì)胞質(zhì)不育基因及不育系與保持系基因組的相似性，以期加深對這2 個胞質(zhì)不育系的了解，為研究其雄性不育機(jī)理及應(yīng)用于配制優(yōu)良雜交種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗使用的疊抱頭球型同核異質(zhì)橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院十字花科蔬菜作物遺傳改良技術(shù)創(chuàng)新實驗室培育而成（表1），不育源12XC5 為普通白菜，11-8 為大白菜。試驗材料于2018 年2 月和8月種植在西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌蔬菜試驗站，每份材料取3 個單株進(jìn)行試驗。

表1 同核異質(zhì)橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系

1.2 不育系不育細(xì)胞質(zhì)基因鑒定

1.2.1 試驗材料種植及DNA 提取 分別取各試驗材料種子20 粒進(jìn)行浸種催芽，待種子露白時播種育苗；當(dāng)幼苗長至4～5 片真葉時移栽到大田；緩苗后，分別選3～5 株生長整齊一致的單株，取葉樣。采樣時，先將2 mL 的離心管滅菌，然后用鑷子取0.2 g 左右的葉片放入離心管中，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存。采用李榮華等（2009）提出的改進(jìn)CTAB 法提取基因組DNA，提取時用磨樣器（Retsch MM400 球磨儀）磨樣。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，采用NanoDrop 2000c 微量紫外分光光度計檢測DNA 的質(zhì)量和濃度，統(tǒng)一稀釋到100 ng·μL-1作為PCR 擴(kuò)增模板。

1.2.2 引物合成 選用已知的3 對細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因擴(kuò)增引物（表2）（王國芳 等，2014）進(jìn)行鑒定，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序參照王國芳等（2014）的方法。擴(kuò)增體系總體積為10 μL，其中包括2 ×TaqMaster Mix for PAGE（Vazyme）5 μL，模板DNA 1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，ddH2O 3 μL。

表2 鑒定細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的特異引物

1.3 不育系與保持系基因組DNA 一致性鑒定

1.3.1 DNA 的提取及檢測 提取及檢測方法同1.2.1。

1.3.2 引物合成 選用已知的28 對大白菜核心SSR 引物（隋光磊 等，2014）對橙色大白菜不育系及其保持系材料進(jìn)行基因組一致性分析。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 擴(kuò)增反應(yīng)程序參照隋光磊等（2014）的方法，擴(kuò)增體系同1.2.3。

1.3.4 電泳檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳參數(shù)設(shè)置：電壓200 V，電流100 mA，時間2 h。電泳結(jié)束后，用0.1%硝酸銀染色5 min，1.5%氫氧化鈉和1%甲醛進(jìn)行顯影，并拍照記錄。選擇清晰易辨的多態(tài)性帶型進(jìn)行統(tǒng)計，在相同遷移率位置，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，缺失記為“—”。利用Excel 軟件計算不育系與保持系的遺傳相似系數(shù)（即不育系和保持系共有擴(kuò)增條帶數(shù)占總擴(kuò)增條帶數(shù)的比值），分析其遺傳相似率。

1.4 不育系與保持系花器比較觀察

2018 年冬季種植不育系及其保持系，2019 年春季開花，在盛花期晴天上午10：00 左右觀察不育系及其各自保持系的主花序花器官形態(tài)并測量。每種材料隨機(jī)取5 株，每株觀察6 朵花，利用游標(biāo)卡尺測量四強(qiáng)雄蕊長、兩弱雄蕊長、四強(qiáng)花絲長、花瓣長、花瓣寬、萼片長、雌蕊長、花柱長，觀察蜜腺大小、花藥形狀、花瓣形狀并拍照記錄，使用IBM SPSS Statistics 23 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.5 不育系與保持系植物學(xué)性狀觀察

2018—2019 年秋季種植不育系及其保持系，在結(jié)球初期和成熟期分別對不育系和保持系的相關(guān)性狀進(jìn)行調(diào)查，蓮座期觀測葉色、葉緣鋸齒、葉緣波狀、絨毛密度、泡狀凸起數(shù)量、泡狀大小、葉色光澤度、葉脈等8 個性狀，成熟期測定株高、開展度、單株質(zhì)量、單球質(zhì)量、球高、球?qū)挕⑼馊~數(shù)等7 個性狀。從植物學(xué)性狀上統(tǒng)計比較不育系和保持系的一致性，具體標(biāo)準(zhǔn)參考《植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南—大白菜》（GB/T 19557.5—2004）。

株高為地上植株基部至植株最頂處的高度（cm），開展度為植株外葉開展縱、橫兩個垂直方向最大距離（cm），單株質(zhì)量為去除根部后的大白菜整株質(zhì)量（kg），單球質(zhì)量為去除外葉后的大白菜質(zhì)量（kg），球高為大白菜葉球底部至頂部的高度（cm），球?qū)挒榇蟀撞饲蚣缱顚挷课坏膶挾龋╟m），外葉數(shù)為成熟期葉球外綠色葉片數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育細(xì)胞質(zhì)基因鑒定

利用3 對已知的細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因特異引物，對參試不育系和保持系材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其中orf224的引物在3 份材料中均未擴(kuò)增出產(chǎn)物；orf138的引物從18C5 和18C6 中均擴(kuò)增出長度約300 bp 的片段，測序結(jié)果與orf138序列一致性為99%；orf222的引物僅在18C6 中擴(kuò)增出700 bp 的條帶，測序結(jié)果與orf222的序列高度同源、一致性為99%（圖1）。說明18C5 僅含有orf138基因，應(yīng)該屬于Ogu 細(xì)胞質(zhì)雄性不育；18C6 同時含有orf138和orf222基因，簡稱Ogu-Nap CMS；3 對引物在保持系中均沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物，即保持系不含不育基因。

2.2 橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系細(xì)胞核DNA 相似性的分子鑒定

用已知的28 對大白菜核心SSR 引物對參試不育系和保持系的各3 個單株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明18C5 與保持系15S1094 的平均遺傳相似系數(shù)為91.11%，18C6 與保持系15S1094 的平均遺傳相似系數(shù)為93.76%（表3）。由此可知，18C6 與保持系15S1094 的遺傳相似性更相近。

表3 橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系的遺傳相似性分析

2.3 橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系花器比較觀察

2 個同核異質(zhì)不育系在春季開花早期低溫條件下均有敗蕾現(xiàn)象，但隨著溫度升高開花趨于正常。對花器觀測發(fā)現(xiàn)，不育系與保持系花色均為黃色；保持系開放花的柱頭略低于雄蕊，花絲較長，花藥呈近長方體，形態(tài)飽滿、有大量淡黃色花粉，雄蕊、蜜腺均正常；不育系18C5 的柱頭明顯高于雄蕊，雄蕊花絲短，花藥呈長錐體、干癟扁平，甚至退化成絲狀，無花粉；不育系18C6 的柱頭略高于雄蕊，雄蕊花絲較短，但較18C5 長，花藥呈錐體、無花粉。2 個不育系的蜜腺數(shù)量均正常，雖然18C5 的蜜腺較小（圖2），但均可以吸引蜜蜂、蝴蝶，正常授粉結(jié)籽。

表4 橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的花器官性狀指標(biāo)

從表4 可以看出，2 個不育系的花瓣長、花瓣寬、四強(qiáng)雄蕊長、四強(qiáng)花絲長均小于保持系，且18C5 小于18C6，達(dá)到顯著或者極顯著差異水平；2 個不育系的兩弱雄蕊長均極顯著小于保持系，但2 個不育系之間差異不顯著；2 個不育系的花柱長和雌蕊長與保持系差異不顯著；2 個不育系的萼片長變化比較特殊，18C5 的萼片長大于保持系，而18C6 的萼片長小于保持系。這說明從不同不育源轉(zhuǎn)育來的2 個同核異質(zhì)不育系花器官的雌蕊沒有受到不育性的影響，而其他器官都不同程度變小，其中18C5 變小較18C6 更嚴(yán)重。

2.4 橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系植物學(xué)性狀比較

從圖3 和表5、6 可以看出，蓮座期，18C5 的葉色、葉緣鋸齒、絨毛密度、泡狀凸起數(shù)量、泡狀大小、葉色光澤度等6 個性狀都與保持系一致，18C6 的葉色、葉緣波狀、泡狀大小、葉色光澤度等4 個性狀與保持系一致，說明蓮座期18C5 與15S1094 更為相似；成熟期。18C6 的株高、開展度、球高、球?qū)挕⑼馊~數(shù)均與保持系差異不顯著，但單株質(zhì)量與保持系的差異達(dá)到極顯著水平，單球質(zhì)量與保持系的差異達(dá)到顯著水平；18C5 的開展度、球高、球?qū)挕⑼馊~數(shù)均與保持系差異不顯著，但株高、單株質(zhì)量與保持系的差異達(dá)到極顯著水平，單球質(zhì)量與保持系的差異達(dá)到顯著水平，說明成熟期18C6 與保持系15S1094 更為相似。

表5 橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系的蓮座期性狀

表6 橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系的成熟期性狀

3 討論與結(jié)論

橙色大白菜富含類胡蘿卜素，對人類健康有益，因此培育橙色大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系對開展橙色大白菜雜種優(yōu)勢利用有重要意義。本試驗對疊抱頭球型橙色大白菜的同核異質(zhì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育基因、雄蕊特征、植物學(xué)性狀進(jìn)行了系統(tǒng)觀察，分析了2 個不育系的不育基因、雄蕊退化特征和植物學(xué)性狀的異同，加深了對這2 個細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的了解。

細(xì)胞質(zhì)不育基因分子鑒定結(jié)果表明，18C5和18C6 攜帶不同的細(xì)胞質(zhì)不育基因，18C5 攜帶orf138不育基因，18C6 攜帶orf138和orf222不育基因，具有細(xì)胞質(zhì)多樣性特點(diǎn)。用大白菜基因組已知的28 對核心SSR 引物對18C5、18C6 及其保持系進(jìn)行遺傳多樣性分析，18C5 和18C6 與保持系的平均遺傳相似系數(shù)分別為91.11%和93.76%，兩者差異不大，但均低于理論相似性96.875%，這可能是由于回交早期沒有進(jìn)行植物學(xué)性狀選擇造成的。

對植株生育期性狀的觀測結(jié)果表明，2 個同核異質(zhì)不育系均花絲短縮、花藥干癟無花粉，不育性100%，雌蕊、蜜腺發(fā)育正常，能正常結(jié)籽，可以用于雜交制種。值得注意的是：蓮座期18C5 與保持系15S1094 的相似度更高；而在成熟期18C6 與保持系15S1094 的相似度更高，即2 個不育系不同發(fā)育時期與保持系相似度不同，表明Ogu 型蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育和Nap 型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育對植物學(xué)性狀有不同的影響，同時發(fā)現(xiàn)2 個不育系的植物學(xué)性狀普遍較保持系有明顯優(yōu)勢，這可能是不育系核質(zhì)雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)，也可能是不育系的回交代數(shù)低或純合程度不夠所顯示的異核結(jié)合的雜交優(yōu)勢還在起作用。該雜種優(yōu)勢是否能遺傳到雜交種中尚不清楚；另外，Ogu 型蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育和Nap 型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育對雜種優(yōu)勢是否有影響，也有待于進(jìn)一步研究。