蒙藥額力根II號對肝纖維化大鼠的保護作用研究*

蘇琪皓，任麗梅，姜鳳霞，武金寶，江振宇

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝損傷的愈合反應，是由各種急慢性損傷引起肝細胞變性、壞死或凋亡，進而激活多種炎癥相關因子的釋放，啟動各種炎癥信號傳導通路，導致肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化的結果[1,2]。在HSCs被激活過程中伴隨著α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)高表達，同時分泌大量的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分，以I型膠原蛋白(type I collagen)和III型膠原蛋白(type III collagen)為主[3,4]。長期臨床實踐證明中蒙藥具有多靶點、多環節、多層次作用的優點，在防治HF中取得了較好的療效[5-7]，在實驗中也發現黃芪甲苷具有抗纖維化作用[8]。內蒙古自治區蒙藥額力根II號是重組方劑，經過中蒙醫人員長期臨床觀察，發現其具有清肝熱、解毒、調理三根、養胃和肝之功效。本實驗通過建立穩定的CCl4大鼠HF模型，給予不同劑量的額力根II號水煎液灌胃，探討了其干預HF的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑與儀器 58只SPF級雄性SD大鼠，體質量為170±10 g，購自北京大學醫學部實驗動物科學部【許可證號為SCXK(京)2010-0002】。額力根II號【由金石榴10 g，柯子、梔子、川楝子、西紅花、扁蕾、紫檀香、丁香、黨參、丹參、黃芪、木香、柴胡、五味子、五靈脂(制)、草果仁、寒水石各5 g，冬蟲夏草1 g，人工牛黃2 g組成，經包頭市蒙中醫院姜鳳霞主任醫師鑒定，由包頭醫學院第二附屬醫院中藥房提供】。將額力根II號1付溶于純凈水200 ml，90℃水浴鍋煮沸1 h，經沙布過濾，得到過濾液；重復上述步驟2次，最后將所有的過濾液放入旋轉蒸發儀濃縮至50 ml，于4℃冰箱保存。CCl4購于棗莊水嵐泰化工有限公司，抗α-SMA購于Leica公司，抗Collagen I購于Abcam公司，抗Collagen III購于Cellsignal公司，二抗等為Leica novocastra NovoLink聚合物檢測系統RE7280-K檢測試劑盒，蘇木素購于福州邁新公司，Masson為廣州維格斯特染試劑盒，血清肝功能試劑盒為寧波美康試劑盒，檢測血清肝纖維化指標試劑盒購于北京北方生物技術有限公司，全自動生化分析儀為東芝TB120全自動生化分析儀，放射免疫分析儀為SN-697全自動雙探頭放射免疫γ計數器。

1.2 模型的制備 將SD大鼠適應性飼養1 w，隨機分為對照組10只和模型組、小劑量組、中劑量組和大劑量額力根II號處理組(各12只)。將CCl4和橄欖油混合，配制成40% CCl4橄欖油溶液。在對照組，給予生理鹽水3 ml.kg-1皮下注射，在其余各組，給予40% CCl4橄欖油溶液3 ml.kg-1腹部皮下注射，首劑加倍，2次/w，持續8 w[9]；自造模第4 w開始，各給藥組分別給予額力根II號水煎液2.0 g.kg-1、4.0 g.kg-1和8.0 g.kg-1灌胃，對照組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，持續給藥5 w。在實驗結束時，模型組、中劑量組和大劑量組各有3只大鼠死亡，小劑量組有2只大鼠死亡。在末次給藥后禁食不禁水，24 h后給予10% 水合氯醛3 ml.kg-1腹腔注射麻醉，經腹主動脈采血，分離血清；從距離肝門部2.0 cm處切取肝組織，置于4% 多聚甲醛溶液中固定，切片，行HE和Masson染色，參考Ishak評分系統[10]行HF評分。采用免疫組織化學染色法檢測肝組織α-SMA、Collagen I和Collagen III表達。

2 結果

2.1 各組血生化指標比較 見表1。

表1 各組大鼠血生化指標比較

2.2 各組血清肝纖維化指標比較 見表2。

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標(比較

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標(比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

只數HA(μg/L)CⅣ(μg/L)LN(μg/L)PⅢNP(μg/L)對照組1089.2±11.321.4±2.321.6±3.51.9±0.4模型組9270.9±14.6①89.4±14.4①74.7±14.4①5.8±1.4①小劑量組10259.8±24.7①88.0±12.6①70.8±22.5①5.2±0.5①中劑量組9189.7±20.2①②80.1±26.7①67.4±15.3①5.2±0.7①大劑量組9152.4±17.5①②50.1±14.4①②65.8±14.7①4.9±0.3①②

2.3 各組大鼠肝組織病理學表現 見圖1。在對照組，在匯管區可見肝細胞少量表達α-SMA和膠原蛋白；在模型組，在纖維化區域可見α-SMA和膠原廣泛高表達；在藥物干預組，在肝纖維化區域炎細胞顯著減少，α-SMA和膠原蛋白表達顯著減弱(圖2、圖3、表3)。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現(Masson，40×)

圖2 各組大鼠肝組織I型膠原表達(免疫組化，40×)

圖3 各組大鼠肝組織III型膠原表達(免疫組化，40×)

表3 各組大鼠肝組織蛋白表達比較

3 討論

肝臟長期受到各種有害因素的刺激后形成難以修復的損傷，即HF的形成，繼續發展可形成肝硬化，進一步導致門脈高壓、肝衰竭、肝性腦病、肝細胞癌等一系列并發癥[11]。研究顯示HF的過程是可逆的，早期藥物干預可延緩或阻止各種慢性肝病的進展，降低肝硬化的發生率[12,13]，故研究治療HF的藥物勢在必行。

本實驗在模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平顯著升高，可能由于CCl4是一種典型的肝臟化學性毒物，長期、多次皮下注射進入肝細胞，經肝細胞p450酶途徑代謝產生大量的CCl3自由基等活性代謝物，使細胞或組織所處的氧化還原穩態環境被破壞，抗氧化酶的活性降低，同時這些活性代謝物攻擊肝細胞膜上的磷脂分子，啟動脂質過氧化的作用，導致肝細胞變性、壞死[14,15]，肝細胞膜通透性增加甚至破裂，胞漿和線粒體內的ALT和AST釋放出來，同時肝損傷會發生膽紅素代謝紊亂，故血清TBIL相應升高[16]。模型組肝組織可見大量的纖維間隔和假小葉形成，膠原增加，LN、HA、PIIINP、CIV水平顯著升高，證明建立了穩定的HF模型。相關文獻研究顯示血清ALT、AST和TBIL的活性與肝損傷程度呈一致性[17]，LN、HA、PIIINP、CIV水平與HF病變程度呈現一致性[18]。本實驗與文獻研究報道相符合。經過額力根II號治療后，大、中劑量組不同程度的減輕了肝損傷，降低了血清ALT、AST、TBIL、HA、PIIINP、CIV水平，肝組織病理學改變呈緩解趨勢，且與藥物劑量有依賴關系。由此表明中、大劑量的額力根II號對HF有一定的保護作用，但是關于其抑制了一條還是多條炎癥傳導通路有待進一步研究。

在正常情況下，肝組織HSCs處于靜止狀態，表達α-SMA非常少。α-SMA作為HSCs的標志物，其表達程度越高代表HSCs活化越顯著。本實驗在模型組肝組織α-SMA、Collagen I和Collagen III表達增強，主要由于肝臟受到CCl4損傷后產生的各種炎癥介質誘導HSCs活化，有大量的α-SMA表達，在活化過程中分泌大量的ECM，導致ECM合成與降解失去平衡[19,20]，故模型組肝組織α-SMA、Collagen I、Collagen III表達顯著增強。經過藥物干預后，在中、大劑量藥物干預組，肝組織α-SMA、Collagen I和Collagen III表達減弱，而且α-SMA表達變化趨勢與Collagen I和Collagen III同步，主要分布在匯管區，說明額力根II號可抑制HSCs激活，使α-SMA的表達降低，減少了ECM中Collagen I和Collagen III的表達，減少了膠原沉積，發揮了抗纖維化的作用，但是關于其抑制HSCs的活化機制需體外培養HSCs進一步驗證。

本實驗存在以下不足：1)與模型組相比較，中、大劑量藥物干預組大鼠血清LN水平和部分肝功能指標無顯著改變，可能與樣本量小或者大鼠的自身差異等因素有關，故在以后研究中需擴大樣本量或開展多中心研究，盡量減少誤差；2)本實驗研究顯示額力根II號具有抗纖維化的作用，但是未對額力根II號藥物的副作用、不良反應等相關指標進行監測，故關于藥物的安全性、副作用等方面需要后續深入研究；3)HF的發病機制非常復雜，是肝損傷后的機體整體參與的修復反應，涉及多個炎癥介質的參與，故以后應深入進行基礎研究，比如采用PCR、蛋白質印跡法和流式細胞術等技術多層次、多角度從藥劑、藥理、動物模型、細胞分子水平等水平研究藥物的作用機制，完整、清晰地表述其抗纖維化的作用機理。

蒙藥額力根II號對CCl4誘導的HF大鼠具有保護作用，其機制可能與抑制了HSCs活化，減少了ECM的合成有關。