血漿Ki67聯(lián)合miRNA-26b檢測診斷肝細胞癌價值分析*

王若宇，伍玉南，唐 丹

細胞核增殖抗原Ki67是反映細胞增殖的核抗原，是目前應用最廣泛的增殖細胞標記之一。臨床上，檢測腫瘤組織Ki67可反映腫瘤細胞增殖水平，預測腫瘤患者預后[1,2]。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在細胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要作用，在腫瘤組織和正常組織其水平存在差異[3]。研究表明，非小細胞肺癌患者癌組織miRNA-26b水平與癌旁組織或良性病變的正常組織相比均顯著下調(diào)，以此診斷非小細胞肺癌的敏感性和特異性分別為79.9%和79.4%。miRNA-26b表達是非小細胞肺癌預后不良的危險因素[4]。本研究采用RT-qPCR法檢測了HCC患者血漿Ki67和miRNA-26b水平，分析了不同臨床和病理學特征患者這兩種指標的差異，或為臨床診斷HCC患者提供新手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年12月～2018年12月我院診治的HCC患者90例，男57例，女33例；年齡28～71歲，平均年齡為(50.1±11.7)歲。診斷符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診斷指南(2015年版)》[5]。另選擇乙型肝炎肝硬化患者60例，男36例，女24例；年齡25～74歲，平均年齡為(48.2±12.0)歲，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》的標準[6]。排除標準：1)入院時肝功能存在嚴重障礙；2)合并其他惡性腫瘤；3)接受放化療及其他輔助治療。本研究通過了我院醫(yī)學倫理委員會的批準，患者簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent、miRNA-26b、U6引物(均購自美國Invitrogen公司)，Ki67和β-actin上下游引物(北京六合華大基因科技股份有限公司)，SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)，無核酸酶水(DEPC處理水，Sigma)。

1.3 血漿miRNA-26b和Ki67水平檢測 抽取外周靜脈血6 mL，置于EDTA抗凝管，1 h內(nèi)在4℃條件下用低速離心機2500 r/m離心10 min。取血漿600μL，分裝于2 mL無RNA酶的EP管中，置于-80℃凍存。在血漿中加入TRIZOL 1 mL，混勻后冰上靜置5 min；加入氯仿200 μL，充分震蕩，冰上靜置5 min，4℃，12000 r/m離心15 min。輕取上層液體，加入異丙醇500 μL，冰上靜置10 min，12000 r/m離心10 min，棄去上清液，留RNA沉淀，加入75%乙醇1 mL，充分混勻，7500 r/m離心5 min，棄去上清液，干燥5 min，加入DEPC 15 μL，溶解RNA。在260 nm和280 nm處檢測吸光度值。當吸光度值>1.8且<2.0時，用于檢測。實時定量qPCR檢測：將提取得到的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。檢測miRNA-26b時以U6作為內(nèi)參，采用SYBR Green I實時熒光定量PCR法檢測。引物設計如下：Ki67上游：5'-ACGAGACGCCTGGTTACTATCA-3'，下游5'-CTGTTTTGCTGCATTCTGTGC-3'；β-actin上游：5'-TCGTGCGTGACATTAAGG-3'，下游5'-AGGAAGGA-AGGCTGGAAG-3’；miRNA-26b上游：5'-GAAGATCTATGGCCCATCTGAGGTTG-3'，下游5'-CCCAAGCTTAAAAACCTGGA-CCACGAAT-3'；U6上游：5'-CTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游5'-AAAATATGCAACGCTTCACG-3’。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。擴增完畢后，進行熔解曲線分析，每個樣本重復檢測3次。Ki67和miRNA-26b RNA相對水平按公式(2-△△Ct法)計算。根據(jù)ROC曲線結(jié)果，確定Ki67和miRNA-26b mRNA水平的臨界值。ROC曲線上兩個指標串聯(lián)試驗是依次進行幾項檢驗項目，先做特異性高的實驗A，A為陽性者再做B。只有試驗結(jié)果為陽性時才判斷為陽性，否則為陰性；并聯(lián)試驗是同時做幾種檢驗項目，其中一項為陽性即判斷為陽性。檢測水平高于臨界值時，為高水平，反之則為低水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料呈非正態(tài)分布，故以【M(Q1,Q3)】表示，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗；繪制ROC曲線，分析血漿Ki67和miRNA-26b診斷HCC的價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿Ki67和miRNA-26b水平比較 HCC患者血漿Ki67水平為【1.6(1.1～2.2)】，顯著高于肝硬化組【0.4(0.1～1.2)，P<0.05】；HCC患者血漿miRNA-26b水平為【0.7(0.3～1.4)】，顯著低于肝硬化組【2.0(1.4～3.0)，P<0.05】。

2.2 不同臨床和病理學特征患者血漿Ki67水平分布比較 將不同腫瘤直徑、Edmonson分級、早期復發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移患者進行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同腫瘤Edmonson分級、早期是否復發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移患者血漿Ki67水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.3 不同臨床和病理學特征患者血漿 miRNA-26b水平分布比較 不同Edmonson分級、早期是否腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移患者血漿miRNA-26b水平存在顯著性差異(P<0.05，表2)。

2.4 血漿Ki67和miRNA-26b水平診斷HCC的效能分析 血漿Ki67診斷HCC的ROC曲線下面積為0.8(95%置信區(qū)間為0.7～0.9)。血漿miRNA-26b診斷HCC的ROC曲線下面積為0.8(95%置信區(qū)間為0.8～0.9)。兩指標聯(lián)合檢測串聯(lián)試驗可提高診斷HCC的特異度，并聯(lián)試驗可提高診斷的靈敏性(表3)。

表1 不同臨床和病理學特征患者血漿Ki67水平分布(%)比較

表2 不同臨床和病理學特征患者血漿 miRNA-26b水平分布(%)比較

表3 血漿Ki67和miRNA-26b診斷HCC的效能

3 討論

HCC 位居世界第五大常見腫瘤。由于HCC 發(fā)病隱匿，病情進展迅速，當患者確診時大多已經(jīng)處于疾病的中、晚期，錯過了手術時機，即使行腫瘤切除術后也很容易復發(fā)[7]。HCC篩查和早期診斷臨床意義重大。然而，目前處于研究階段的大量 HCC標志物，診斷的準確性并不優(yōu)于影像學方法或血清AFP，且絕大多數(shù)未進入臨床應用[8-11]。因此，尋找有效的診斷HCC生物標志物是目前臨床診斷和治療HCC患者亟待解決的關鍵性問題。

腫瘤學研究的一個重要問題是預測腫瘤的進展和患者的生存率。傳統(tǒng)上，腫瘤的類型、分期和細胞有絲分裂活性是主要的預后標準[10]。Ki67是一種非組蛋白核皮質(zhì)蛋白，參與聚合酶I依賴性核糖體RNA合成的早期步驟。Ki67水平在整個細胞周期內(nèi)都在變化，在有絲分裂期間達到峰值水平。雖然Ki67的功能尚未完全闡明，但有證據(jù)表明它在細胞分裂和核糖體RNA合成中起作用[12-14]。因此，Ki67的重要性越來越大，特別是在生長緩慢的腫瘤，如胃腸道胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(GEP-NENS)[15-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC患者血漿Ki67水平升高，而且在不同Edmonson分級、是否存在早期腫瘤復發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移的HCC患者血漿Ki67水平顯著不同。ROC曲線分析結(jié)果表明，血漿Ki67水平診斷HCC的ROC曲線下面積為0.8，其相應的診斷靈敏性和特異度分別為55.6%和95.0%，提示血漿Ki67水平是可以作為診斷HCC的一個新指標。

近年來，miRNA的發(fā)現(xiàn)和深入研究為腫瘤靶向研究提供了新的思路，成為目前腫瘤靶向治療研究的最新熱點。采集患者外周血并檢測miRNAs，方法簡單、方便，更容易被患者和臨床醫(yī)生所接受，且miRNA 具有非常強的穩(wěn)定性，常溫放置超過 24 h、反復凍融、強酸強堿等極端條件都不影響其穩(wěn)定性[18-20]。研究表明，miRNA作為癌基因或腫瘤抑制因子而發(fā)揮作用。作為腫瘤相關小RNA之一的miRNA-26b可能在功能上能調(diào)節(jié)癌細胞的生長，如在人食管癌、鼻咽癌、原發(fā)性鱗狀細胞肺癌和舌鱗狀細胞癌等。此外，一些研究報告發(fā)現(xiàn)，在一些癌癥，如乳腺癌和胃癌，miRNA-26b水平下調(diào)，表明miRNA-26b是一種腫瘤抑制因子。miRNA-26b的過度表達可顯著抑制體外肺癌細胞或結(jié)腸癌細胞等腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，抑制腫瘤的生長[19，20]。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-26a可通過HGF-cMet信號抑制HCC組織血管生成，從而抑制 HCC的生長和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，是肝癌新的治療靶點和預后指標。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC患者血漿miRNA-26b顯著低于乙型肝炎肝硬化患者。不同腫瘤Edmonson分級、是否存在早期腫瘤復發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移的HCC患者血漿miRNA-26b水平顯著不同。ROC曲線分析結(jié)果表明，血漿miRNA-26b水平診斷HCC的ROC曲線下面積為0.8，其相應的診斷靈敏性和特異度分別為70.0%和83.3%。血漿Ki67和miRNA-26b聯(lián)合診斷的效能與血漿Ki67或miRNA-26b單獨指標比，診斷效能顯著提高，可為HCC的診斷提供重要的參考信息。