羥基磷灰石純化藻藍蛋白的優化研究及機理分析

方 艷, 武 康, 趙冰冰, 汪家權

(合肥工業大學 資源與環境工程學院,安徽 合肥 230009)

目前, 巢湖治理藍藻 (主要是微囊藻、念珠藻和魚腥藻等幾種混合藻) 爆發的重要應急措施依舊是傳統的機械和人工打撈[1], 藍藻在生長過程中吸收了湖泊中大量的氮磷等營養物質,打撈藍藻可以將水體的氮磷帶走,而這種不經過恰當處理打撈上岸的藍藻會造成二次污染[2]。經過研究者對巢湖藍藻的分析可知,其中藻藍蛋白的含量達5%以上[3],高純度的藻藍蛋白具有抗炎性[4]、抗癌性[5]、抗氧化性[6]、免疫熒光性[7]等生物活性。對藍藻中藻藍蛋白進行有效利用會大大減少藍藻帶來的危害,還能進一步做到資源化利用。國內外專家研究藻藍蛋白的提取和純化方法表明,一般采用鹽析[8]、雙水相[9]、柱層析[10-11]等技術。通過相關技術得到的高純度藻藍蛋白在一定領域中用途廣泛。目前,很多研究探討了藻藍蛋白的提取與純化方法,而對于相關方法制備得到的藻藍蛋白分析較少。響應面方法分析藻藍蛋白純度與回收率,可以從多維度、廣角度、深層次綜合利用水華藍藻對人類醫療美容事業以及將純度高的藻藍蛋白用于生物技術與環保事業提供了一定的思路和參考。

本文以羥基磷灰石為金屬螯合親和色譜填料,通過柱色譜分離純化藻藍蛋白,在考察洗脫液pH、離子強度、洗脫速度3個單因素對藻藍蛋白純度和回收率影響的基礎上,通過響應面法對藻藍蛋白純度和回收率進行分析,促進藻藍蛋白提取純化更廣闊的開發和利用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

巢湖藍藻藻泥采集自位于合肥市濱湖區的巢湖西湖區水體,距水體表層0.15 m處。主要試劑為CHT-B型羥基磷灰石、硫酸銨(NH4)2SO4、磷酸二氫鈉NaH2PO4、磷酸氫二鈉Na2HPO4、氫氧化納NaOH 、氯化鈉NaCl 、鹽酸HCl。實驗儀器為HJ-6恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)、KDC-160HR低溫高速離心機(安徽中科中佳儀器公司)、DGT-G電熱恒溫干燥箱(合肥華德利科學器材有限公司)、QuickSep中高壓層析系統(北京慧德易科技有限責任公司)、Vantage-L層析柱(美國Millipore公司)、UV/VIS-1950紫外-可見分光光度儀(北京普析通用公司)。

1.2 實驗方法

(1) 藻藍蛋白粗提液的制備。將含水率為96.4%的巢湖藻泥自冷庫內取出,于室溫下水浴解凍,如此反復凍融3次后,經4層紗布過濾除去不溶物質。所得上清液再于低溫高速(-4 ℃,8 000 r/min)條件下離心20 min除去變性蛋白,得到藻藍蛋白粗提液。

(2) 兩步分段鹽析。向藻藍蛋白粗提液中緩慢加入1.2 mol/L (NH4)2SO4,并用恒溫磁力攪拌器不斷攪拌直至全部溶解,靜置20 min后低溫高速離心,分離一步鹽析的上清液和沉淀,以達到去雜的目的。再向收集的上清液中追加 (NH4)2SO4至1.8 mol/L,攪拌直至全部溶解,靜置20 min后低溫高速離心,分離二步鹽析的上清液和沉淀,以達到沉淀分離純化的目的。

(3) 透析脫鹽。將分離的二步鹽析沉淀溶解于10 mmol/L的PBS中,轉移進透析袋中并保證密封性,然后放入10 mmol/L的PBS透析液中,低溫透析24 h,期間更換透析液3次以上以保證脫鹽效果。

(4) 柱色譜分離純化。先將羥基磷灰石用堿液浸泡1 h后裝柱,柱型為1.6 cm×50 cm,柱床高22 cm。再用10 mmol/L、pH值為7的磷酸鹽緩沖液沖洗色譜柱柱床,使填料達到陰陽離子平衡。將脫鹽后的樣品上樣,先后以不同濃度梯度(0.02 mol/L PBS、0.10 mol/L PBS、0.20 mol/L PBS,另加0.1 mol/L NaCl)的洗脫液進行階段洗脫,洗脫速度為5 mL/min,收集洗脫的組分,測量藻藍蛋白和別藻藍蛋白的純度和濃度。

(5) 單因素實驗。采用控制變量法,每組分別單獨改變洗脫液的pH、離子強度、洗脫速度,進行單因素優化實驗。每組實驗重復3次,取平均值,使用origin軟件進行數據分析。

1.3 分析方法

根據藻藍蛋白和別藻藍蛋白的光譜學特性來表征藻藍蛋白的純度與濃度:藻藍蛋白和別藻藍蛋白不僅各在620 nm與650 nm處有典型的特征吸收峰,而且與一般蛋白質相同，在280 nm處也有相應吸收峰[8,12]。

藻藍蛋白純度為:

P=A620/A280，

藻藍蛋白(phycocyanin,PC)質量濃度為:

ρPC=(A620-0.7A650)/7.38，

藻藍蛋白的回收率為:

R=100ρPCVt/(ρPC0V0)。

別藻藍蛋白純度為

P=A650/A280，

別藻藍蛋白(apuophycocyanin,APC)質量濃度為:

ρAPC=(A620-0.7A650)/7.38，

別藻藍蛋白的回收率為：

R=100ρAPCVt/ρAPC0V0。

其中:A280、A620、A650分別為280、620、650 nm波長處的吸光度;Vt為柱色譜純化后藻藍蛋白或別藻藍蛋白溶液的體積；ρPC0、ρAPC0為藻藍蛋白和別藻藍蛋白進樣時的質量濃度；V0為藻藍蛋白或別藻藍蛋白的進樣體積。

純化的藻藍蛋白或別藻藍蛋白純度≥3.0可作為藥品級,其回收率簡稱為3.0回收率;純度≥4.0為試劑級藻藍蛋白或試劑級別藻藍蛋白,其回收率簡稱為4.0回收率。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 洗脫液pH值實驗

pH對藻藍蛋白與別藻藍蛋白純度和回收率的影響如圖1所示。

圖1 pH對藻藍蛋白與別藻藍蛋白純度和回收率的影響

由圖1可知:藻藍蛋白和別藻藍蛋白純度隨著pH值的增加,均先增大后減小,但藻藍蛋白在pH=6.5時達到最大為4.23,別藻藍蛋白在pH=7.0時達到最大為4.18;試劑級藻藍蛋白回收率(CPC 4.0回收率)和試劑級別藻藍蛋白回收率(APC4.0回收率)隨著pH值的增加均先增大后減少,但藻藍蛋白在pH值 6.5時達到最大為28.59%,別藻藍蛋白在pH=7.0時達到最大為6.35%,這是因為藻藍蛋白與別藻藍蛋白的等電點和氨基酸組成略有差異,所以變化趨勢略有不同。由于藻藍蛋白與別藻藍蛋白的組氨酸咪唑基、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸巰基等與鈣離子間可形成穩定的螯合物[13],而洗脫液pH值影響兩者與鈣離子螯合反應的平衡常數和自身酸堿性,從而決定吸附劑對兩者吸附效果。

本文實驗以提純試劑級藻藍蛋白為最終目的,故選擇藻藍蛋白純化結果為判斷依據,結果表明在pH=6.5時,藻藍蛋白為堿性蛋白質,與雜蛋白和鈣離子螯合時具有相對競爭優勢,此時純度與回收率最高,故最適pH值應為6.5。

2.1.2 離子強度實驗

離子強度對藻藍蛋白與別藻藍蛋白純度和回收率的影響如圖2所示。

圖2 離子強度對藻藍蛋白與別藻藍蛋白純度和回收率的影響

由圖2可知:藻藍蛋白純度和試劑級回收率隨著磷酸鹽離子強度的增加而先增大后減小,在0.08 mol/L時均達到最大,分別為4.32%和32.80%;別藻藍蛋白純度和回收率隨著離子強度的增加雖略有波動但總體相差不大,這是由于改變的洗脫液磷酸鹽離子強度的階段對應著藻藍蛋白的洗脫階段,別藻藍蛋白洗脫階段雖略受影響但總體較穩定。由于離子強度大小影響磷酸鹽離子對藻藍蛋白等堿性蛋白質的競爭作用,從而決定填料對藻藍蛋白等堿性蛋白的吸附容量。結果表明離子強度為0.08 mol/L時,藻藍蛋白、雜蛋白與填料的螯合作用在此時會相差較大,因而能夠相對較多地解吸洗脫下來,故最適離子強度應為0.08 mol/L。

2.1.3 洗脫速度實驗

洗脫速度對藻藍蛋白與別藻藍蛋白純度和回收率的影響如圖3所示。

圖3 洗脫速度對藻藍蛋白與別藻藍蛋白純度和回收率的影響

由圖3可知:藻藍蛋白與別藻藍蛋白純度和回收率均隨著離子強度的增加而先增大后減小,且在洗脫速度為3 mL/min時達到最大值,分別為 4.39%、35.94%和4.41%、8.16%;醫藥級藻藍蛋白和別藻藍蛋白回收率隨著洗脫速度的增加先呈波動狀態,這是由于受洗脫效果影響,醫藥級回收率可能與試劑級回收率同步增長,也可能由于總回收率的限制,會與試劑級回收率呈現出反向增長。洗脫速度會影響色譜柱的柱效,過快會降低分離效果和容量,因為螯合反應往往需要較長的反應時間才能達到平衡[14]。結果表明洗脫速度為3 mL/min時,色譜柱柱效與分離速度適當,洗脫峰不會過寬或過尖,純度與回收率最高,分離效果較好,故最適洗脫速度應為3 mL/min。

2.2 羥基磷灰石柱色譜法響應面實驗

在單因素的基礎上,通過單因素方差分析,以洗脫液pH值、離子強度、洗脫速度為影響因素,以藻藍蛋白純度和回收率為響應變量,響應面實驗因素水平見表1所列。

表1 實驗因素水平表

純度為響應變量的響應面圖如圖4～圖6所示。

圖5 pH與洗脫速度交互作用

圖6 離子強度與洗脫速度

由圖4可知,每個響應面圖均有明顯的峰值,最佳工藝參數在各因素的取值范圍內,表明本次實驗設計有效。圖4中pH值與離子強度的響應面坡度較陡峭,在XY平面上的等高線密集,顏色變化快,隨著pH值與離子強度的變化,回收率的響應面亦發生變化,這說明pH值與離子強度之間并不是獨立作用,而是存在一定的交互作用,彼此相互制約,相互影響。這可能是由于柱色譜的填料羥基磷灰石對藻藍蛋白的吸附與洗脫效果會受到洗脫液的pH值與離子強度雙重影響,造成純化后藻藍蛋白的回收率會受到洗脫液pH值與離子強度的交互作用影響[15]。

圖5中XY平面上的等高線稀疏且呈規則的圓形,而響應面曲面坡度只在其中一個影響因素變化時坡度比較陡峭,在另一個影響因素變化時坡度平緩,說明2個因素之間不存在顯著的交互作用,表明此時pH值與洗脫速度不發生顯著的交互作用。

圖6中離子強度與洗脫速度的響應面坡度較陡峭,在XY平面上的等高線密集,顏色變化快,隨著離子強度與洗脫速度的變化,回收率的響應面變化迅速而明顯,對應的等高線圖有一定程度的橢圓化,這說明離子強度與洗脫速度之間并不是獨立作用,而是存在一定的交互作用,彼此相互制約,相互影響。這可能是由于柱色譜的填料羥基磷灰石對藻藍蛋白的吸附容量和分離效果會受到洗脫液的離子強度與洗脫速度雙重影響,造成純化后藻藍蛋白的回收率會受到洗脫液離子強度與洗脫速度的交互作用影響。

由以上分析可知,響應面曲面圖與等高線圖所反映的各影響因素間的交互作用及顯著性與方差分析中的結論保持一致。

以回收率為響應變量的響應面圖與以純度為響應變量的響應面圖具有趨同性,回收率變化規律與純度相近,因此回收率響應面圖以純度響應面圖為例。

通過數學分析確定了藻藍蛋白的最佳模擬工藝參數為洗脫液pH值為6.32、離子強度為0.08 mol/L、洗脫速度為3.56 mL/min,在此條件下,藻藍蛋白純度與回收率的理論最佳值為4.52%和38.36%。為了驗證該實驗結果的可靠性,在上述最佳模擬工藝參數的條件下進行3次重復實驗取平均值,藻藍蛋白純度與回收率的均值為4.51%與38.38%。實驗值與模型預測值比較接近,模型擬合度高[16]。因此,通過響應面實驗設計對羥基磷灰石純化藻藍蛋白進行優化是可行的,且由于考慮到各影響因素的交互作用,與單因素實驗相比,更接近實際情況。

2.3 機理分析

2.3.1 藻藍蛋白的紫外-可見光譜特征分析

實驗流程中各工藝階段中藻藍蛋白樣品的紫外-可見吸收光譜圖如圖7所示。由圖7可知,一步鹽析工藝與粗提液的峰形基本相同,但強度略低,這表明一步鹽析工藝會去除部分雜蛋白及少量藻藍蛋白,藻藍蛋白的純度略有上升。二步鹽析工藝會伴隨有紅移現象:蛋白質吸收峰由264 nm紅移至276 nm處;藻藍蛋白副吸收峰由332 nm紅移至360 nm處。這表明二步鹽析將藻藍蛋白從溶液中沉淀,在此過程中去除了大量核酸,因此會出現上述紅移現象[17]。蛋白質吸收峰強度下降,藻藍蛋白典型吸收峰(620 nm處)強度上升,雜蛋白也被大量去除,藻藍蛋白的純度顯著上升。經過柱色譜工藝后,蛋白質吸收峰強度進一步下降,藻藍蛋白典型吸收峰與副吸收峰強度顯著上升,同時峰形由對稱變為非對稱,這表明已經進一步去除大量雜蛋白,從而藻藍蛋白的純度達到了試劑級。

圖7 各工藝紫外可見吸收光譜圖

2.3.2 試劑級藻藍蛋白熒光光譜圖

經羥基磷灰石純化藻藍蛋白后得到的試劑級樣品的熒光光譜圖如圖8所示。

圖8 試劑級藻藍蛋白熒光光譜圖

由圖8可知，對試劑級藻藍蛋白溶液進行熒光光譜掃描,激發光波長范圍為580～640 nm,獲得熒光激發光譜,最大熒光激發峰位于632.4 nm。用固定波長620 nm光照射,獲得熒光發射光譜,最大熒光發射峰為643.6 nm。從發射峰峰形和強度來看約于638 nm處呈現鏡像對稱。由藻藍蛋白的屬性可知,藻藍蛋白分子于純化過程中并未變性,仍然保持著生物活性。經此工藝純化的試劑級藻藍蛋白分子具有完整的化學結構(包括高級結構)以及相應的生物學功能,說明了所選擇工藝適合于純化藻藍蛋白。

2.3.3 藻藍蛋白的紅外光譜特征分析

實驗工藝流程中各工藝階段中藻藍蛋白樣品的紅外吸收光譜圖如圖9所示。由圖9可知,1 658 cm-1處為νC=O的吸收峰,1 537 cm-1處為反式酰胺構型中NH的吸收峰,1 400 cm-1處為順式酰胺構型中NH的吸收峰[18]。這表明粗提液中蛋白質具有α-螺旋和β-折疊2種結構。因為一步鹽析工藝加入大量硫酸銨,所以νNH導致3 421 cm-1峰頻率向低頻方向移動,1 400 cm-1峰強度大幅度增加,表明NH4+對樣品紅外吸收的干擾;同時出現νS=O的吸收峰(1 112 cm-1)和νSO的吸收峰(617 cm-1),對應SO42-對樣品紅外吸收的干擾[19];硫酸銨的大量加入會擾亂蛋白質的二級結構。二步鹽析工藝后,藻藍蛋白溶液中硫酸銨濃度下降。經過柱色譜工藝后,已充分脫鹽;從C=O 基團所在峰的位置、形狀(1 658 cm-1處)表明藻藍蛋白主要以締合體形式存在,1 537 cm-1處的吸收峰表明藻藍蛋白二級結構以α-螺旋為主。

圖9 各工藝紅外吸收光譜圖

3 結 論

(1) 羥基磷灰石柱色譜法純化藻藍蛋白單因素實驗的優化條件分別為pH 值6.5、離子強度0.08 mol/L、洗脫速度3 mL/min。此時藻藍蛋白純度最高可達4.42,試劑級藻藍蛋白回收率最高為36.93%。

(2) 對羥基磷灰石柱色譜法純化藻藍蛋白響應面實驗結果使用二次回歸方程模擬,并進行方差分析與顯著性檢驗,模型與實驗結果擬合度良好。P值、等高線與響應曲面等表明,pH值與離子強度之間、離子強度與洗脫速度之間具有顯著的交互作用,而pH值與洗脫速度之間不具有顯著的交互作用,洗脫速度為低速時柱色譜的吸附-解吸效果更穩定,改變離子強度洗脫時與其他影響因素交互作用顯著。

(3) 根據響應面實驗二次回歸方程模擬的結果,最佳工藝參數為洗脫液pH值6.32、離子強度0.08 mol/L、洗脫速度3.56 mL/min。在此條件下,藻藍蛋白純度與回收率的理論最佳值為4.52%和38.36%,實驗3次均值為4.51%與38.38%,純化效果優于單因素實驗結果。

(4) 通過對藻藍蛋白進行紫外-可見光譜、熒光光譜和紅外光譜分析,表明本文所選工藝適合提純試劑級藻藍蛋白。