高CO2濃度和葉面施鋅對稻米鋅營養的影響

楊陽，戶少武，牛璽朝，童楷程，陳晨，楊連新，王云霞*

（1.揚州大學環境科學與工程學院，江蘇 揚州225009；2.揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現代產業技術協同創新中心，江蘇 揚州225009）

水稻是重要的糧食作物，大米是世界上半數以上人口的主食[1]。稻米中的主要成分淀粉是以大米為主食人群的主要熱量來源，蛋白質和鋅、鐵等微量元素對維持人體健康及免疫系統至關重要。缺鋅可能導致生長遲緩、免疫力下降、學習障礙、智力遲鈍、DNA損傷、冠心病甚至癌癥[2]。目前，鋅缺乏已被列為影響全球人類健康的主要危險因素之一[3]。據報道，在以水稻為主食的地區，缺鋅人口的數量占總人口的34%～73%，這主要是由于大米中的鋅含量及鋅的生物有效性較低[4?5]。因此，提高糧食作物中的鋅濃度及其生物有效性，改善人類健康，是一項重要的全球性挑戰。

自工業革命以來，人類活動加劇使大氣二氧化碳（CO2）濃度不斷增加，預計到本世紀中葉將上升到550μmol·mol?1[6]。高濃度CO2促進作物的光合作用，從而使作物生物量及產量增加[7]。但是大氣CO2濃度升高情形下稻米蛋白質、維生素等營養素濃度多呈降低趨勢，這可能導致以大米為主食人群營養缺乏的風險[8]。稻米微量元素鋅對CO2濃度升高的響應多為顯著降低或沒有影響，不同試驗中響應不一致可能與供試品種、栽培和氣候條件不同有關[9]。

前人關于高CO2濃度對稻米鋅濃度影響的研究較多，但關于鋅生物有效性影響的報道非常少。鋅的生物有效性常以植酸與鋅摩爾比來表示。因為大米中的鋅與植酸形成植酸鹽，不容易被人體小腸直接吸收，從而降低了鋅的生物有效性[10]。植酸與鋅摩爾比＜10時，植酸對人體吸收鋅的影響很小，當植酸與鋅摩爾比超過15時，鋅的吸收被抑制[11]。因此大米植酸含量的高低直接影響鋅的生物有效性，截至目前僅有的幾例研究認為大氣CO2濃度升高對稻米植酸濃度沒有顯著影響[12?14]。

鋅生物強化是提高水稻籽粒鋅含量和鋅生物有效性的有效途徑，是解決人類缺鋅問題的一種經濟且可持續的方法[15]。基因生物強化和農藝生物強化是提高水稻籽粒鋅濃度的兩種重要措施[3]。其中農藝生物強化策略（例如施鋅肥）是提高水稻籽粒中鋅濃度的一種快速有效的方法[5]。鋅肥的使用一般包括土壤施用、鋅溶液浸種和葉面施用[3]。近年來，通過葉面施鋅進行稻谷中鋅的生物強化應用廣泛，它具有施用量低和避免土壤固定的優點[3]。葉面施用的鋅可以被葉表皮吸收，并通過韌皮部轉移到水稻籽粒中[16]。通常葉面施用鋅肥使糙米鋅濃度的增加幅度大于土壤施用[17]。據報道，小麥土壤施鋅時鋅肥利用率只有不到1%，葉面施用時鋅肥利用率可達8%以上[18]，但水稻鋅肥利用率對高CO2濃度的響應未見報道。

縱觀前人研究，大氣CO2濃度升高對稻米鋅濃度影響的前期研究較多，但通常供試品種較少，特別是新選育的高產優質超級稻品種；相對鋅濃度、高CO2濃度對稻米鋅生物有效性影響的報道非常少，對籽粒鋅肥利用率的影響則未見報道。為此，本研究依托自由空氣中CO2濃度增高（Free Air CO2Enrichment，FACE）技術平臺，以大田生產使用較廣的9個品種為供試材料，設置CO2濃度、品種以及花后葉面施鋅三因子試驗，成熟期測定糙米產量、鋅濃度、鋅生物有效性以及鋅肥利用率，研究這些參數對CO2和鋅處理的響應及其品種間差異，為未來高濃度CO2環境下制訂生物強化策略提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗于2018年依托我國稻田FACE技術平臺進行，該平臺位于江蘇省揚州市小紀鎮良種場試驗田內（32°35′50″N，119°42′00″E）。FACE平臺設有對照（Ambient）圈及FACE圈各3個，直徑為12 m，面積約為80 m2，且各圈層之間間隔均大于90 m[19]。平臺運行時，純CO2氣體通過FACE圈周圍架設的管道上小孔向中心噴射。通過CO2監測儀和計算機網絡系統實時監控各圈的CO2濃度。處理圈純CO2氣體釋放的速度和方向根據大氣中CO2濃度、風向、風速以及作物冠層高度的目標CO2濃度進行自動調節，從而使水稻主要生育期FACE圈內CO2濃度比大氣環境高200μmol·mol?1。試驗田為水稻?冬閑單季種植，其土壤理化性質為：pH 7.1，有機質24.8 g·kg?1，全氮2.18 g·kg?1，全鉀9.0 g·kg?1，全磷0.55 g·kg?1，堿解氮146.5 mg·kg?1，速效鉀51.9 mg·kg?1，速效磷17.2 mg·kg?1，有效鋅6.08 mg·kg?1。

本試驗為裂裂區設計，以CO2濃度、水稻品種、鋅處理為主區、裂區和裂裂區。CO2處理設置為環境CO2濃度（Ambient）和高CO2濃度（比Ambient高200 μmol·mol?1），各3個重復。鋅處理設置2個水平，分別為對照（不施鋅處理）和0.2%鋅肥處理（以溶液中的Zn2+計）。葉面噴施的鋅肥為ZnSO4溶液（800 L·hm?2，含有0.01%Tween?20）。水稻開花之后的2周，籽粒鋅積累迅速增加，故水稻從抽穗期開始進行葉面鋅處理，每隔5 d噴施一次，共3次[20?22]。噴施時為避免交叉感染，用塑料薄膜將處理植株與對照植株分隔開來。

1.2 材料培育

本研究以大田生產使用較廣的9個品種為材料進行試驗，淮稻5號（常規粳稻）、南粳46（常規粳稻）、南粳5055（常規粳稻，超級稻）、武運粳27（常規粳稻，超級稻）、揚稻6號（常規秈稻）、豐優香占（秈型三系雜交稻）、隆兩優1988（秈型兩系雜交稻，超級稻）、深兩優136（秈型兩系雜交稻，超級稻）和甬優1540（秈粳雜交稻，超級稻）。大田旱育秧：5月18日浸種，3 d后播種，6月20日移栽。移栽密度為24穴·m?2（株行距為16.7 cm×25 cm），粳稻每穴2株，秈稻和雜交稻每穴1株。施氮總量為22.5 g·m?2，其中40%、30%、30%分別作為基肥、分蘗肥和穗肥，分別于6月19日、6月29日和7月28日施用；磷、鉀肥施用量均為9 g·m?2，全部作基肥施用。基肥使用復合肥（N∶P∶K=15∶15∶15），追肥使用尿素（含氮率為46.7%）。水分管理：6月17日至7月20日保持3 cm水層；7月21日至8月10日期間多次輕擱田；8月11日至成熟期收獲前10 d間歇灌溉之后斷水至收獲。

1.3 測定內容

糙米產量的測定：水稻成熟期時選取長勢基本一致的具有代表性的植株5穴，手工脫粒，曬干后用風選儀（FX?Ⅱ，匯爾公司，杭州）分出飽粒，經礱谷機出糙后稱質量得到糙米產量。

糙米用磨粉機（盤式振動研磨儀TS1000，Siebtechnik，德國）磨成細粉待用。

糙米鋅元素的測定：稱取0.100 g烘干米粉樣品，在馬弗爐中480℃高溫灰化14 h，待灰分冷卻后加入2 mL 15%的進口純硝酸溶解，靜置24 h后用超純水定容至10 mL，將溶液混勻后過濾。最后用ICP?AES（IRISIntrepidⅡXSP，Thermo Elemental，美國）測定濾液中的鋅元素濃度。同時用大米粉標準品[GBW（E）080684a，國家糧食局科學研究院]進行質量控制。

糙米植酸濃度的測定：參考Vaintraub等[23]的方法并進行適當改進，具體方法為：稱取烘干米粉樣品0.250 g，加入5 mL 0.7%HCl振蕩提取1 h（25℃，150 r·min?1）后離心（4 000 r·min?1，15 min），上清液經顯色劑顯色后用酶標儀（SpectarMAX PLUS384，美國）測定500 nm波長下的吸光度值；根據植酸標準曲線計算樣品中的植酸濃度。

相關指標計算方法：

糙米鋅累積量（mg·m?2）=糙米產量（g·m?2）×糙米鋅濃度（mg·kg?1）/1 000

籽粒鋅肥利用率=［施鋅處理籽粒鋅累積量（g·hm?2）－不施鋅處理籽粒鋅累積量（g·hm?2）］/施鋅量（以純鋅計）（g·hm?2）×100%[24?25]

1.4 數據分析

本實驗數據用Excel 2010處理并進行圖表繪制，用SPSS（19.0）進行裂裂區方差分析。

2 結果與分析

2.1 高CO2濃度和葉面施鋅對不同水稻品種糙米產量的影響

高CO2濃度和花后葉面施鋅對不同水稻品種糙米產量的影響見圖1。結果表明：供試品種糙米產量變幅為565.0～1 175.9 g·m?2，品種間存在極顯著差異。CO2濃度升高使糙米產量從785.4 g·m?2增加到908.4 g·m?2，增幅為15.7%，差異達極顯著水平；從不同品種看，高CO2濃度環境下所有水稻品種糙米產量均呈增加趨勢，增幅為7.8%～23.2%，其中淮稻5號、南粳5055、武運粳27、揚稻6號和深兩優136分別增加23.2%、16.4%、17.0%、25.1%和15.6%，均達顯著水平。花后葉面施鋅對糙米產量無顯著影響，但是不同CO2條件下，葉面施鋅對糙米產量的影響不同，表現為CO2與鋅處理之間存在顯著的互作效應。具體表現為環境CO2濃度下，葉面施鋅使南粳5055、揚稻6號和隆兩優1988糙米產量增加，而高CO2濃度下，葉面施鋅使相應品種糙米產量呈下降的趨勢。

2.2 高CO2濃度和葉面施鋅對不同水稻品種糙米鋅濃度的影響

高CO2濃度和花后葉面施鋅對不同水稻品種糙米鋅濃度的影響見圖2。供試品種糙米鋅濃度的變幅為20.7～39.6 mg·kg?1，品種間差異達極顯著水平。高CO2濃度對糙米鋅濃度的影響不顯著，不同品種趨勢一致。與對照不施鋅處理相比，葉面鋅處理使所有品種糙米鋅濃度從24.9 mg·kg?1增加到34.2 mg·kg?1，增幅為37.3%，差異達極顯著水平；從不同品種看，花后葉面鋅處理使淮稻5號、南粳46、南粳5055、武運粳27、揚稻6號、豐優香占、隆兩優1988、深兩優136、甬優1540糙米鋅濃度平均分別極顯著增加45.6%、41.6 %、52.7%、31.8%、20.3%、32.8%、41.8%、34.8%、38.9%。方差分析表明，鋅處理與品種之間存在極顯著互作，而其他處理間均無互作效應。

2.3 高CO2濃度和葉面施鋅對不同水稻品種糙米植酸濃度的影響

高CO2濃度和花后葉面施鋅對不同水稻品種糙米植酸濃度的影響見圖3。供試品種糙米植酸濃度變幅為7.4～10.5 g·kg?1，品種間差異達極顯著水平。高CO2濃度對糙米植酸濃度的影響不顯著，不同品種趨勢一致。花后葉面施鋅對糙米植酸濃度的影響不顯著，不同品種趨勢一致。方差分析表明，各處理間均無顯著互作效應。

2.4 高CO2濃度和葉面施鋅對不同水稻品種糙米植酸與鋅摩爾比的影響

鋅的生物有效性常以植酸與鋅的摩爾比來表示，高CO2濃度和花后葉面施鋅對不同水稻品種糙米植酸與鋅摩爾比的影響見圖4。供試品種糙米植酸與鋅摩爾比最小為22.7，最大為45.1，品種間存在極顯著差異。高CO2濃度對糙米植酸與鋅摩爾比無顯著影響，且不同品種趨勢一致。花后葉面施鋅使所有供試品種糙米植酸與鋅摩爾比平均降低10.7，降幅為29.1%，達極顯著水平；從不同品種看，花后葉面鋅處理使淮稻5號、南粳46、南粳5055、武運粳27、揚稻6號、豐優香占、隆兩優1988、深兩優136、甬優1540糙米植酸與鋅摩爾比平均分別降低30.7%、29.3%、38.3%、25.6%、20.4%、23.3%、37.3%、28.5%、26.7%，各品種均達顯著水平。方差分析表明，鋅處理與品種之間存在顯著互作，而其他處理間均無互作效應。

2.5 高CO2濃度和葉面施鋅對不同水稻品種糙米鋅累積量的影響

高CO2濃度和花后葉面施鋅對不同水稻品種糙米鋅累積量的影響見圖5。供試品種糙米鋅累積量變幅為13.9～38.9 mg·m?2，品種間存在極顯著差異。CO2濃度升高使糙米鋅累積量從22.9 mg·m?2增加到27.0 mg·m?2，增幅為17.9%，差異達極顯著水平；從不同品種看，高CO2濃度使供試品種淮稻5號、南粳46、南粳5055、武運粳27、揚稻6號、豐優香占、隆兩優1988、深兩優136、甬優1540糙米鋅累積量平均分別增 加26.9%、20.8%、20.3%、24.3%、18.2%、10.2%、13.9%、16.9%、17.1%，其中南粳5055、深兩優136、武運粳27、揚稻6號達到P＜0.1顯著水平。花后葉面鋅處理使糙米鋅累積量從21.0 mg·m?2增加到28.9 mg·m?2，增幅為37.6%，差異達極顯著水平；從不同品種看，花后葉面施鋅使對應品種糙米鋅累積量平均分別增 加40.9%、42.0%、60.8%、20.9%、22.8%、34.7%、54.3%、24.9%、43.3%，除武運粳27和揚稻6號外，均達顯著水平。方差分析表明，各處理間均無顯著的互作效應。

2.6 高CO2濃度對不同水稻品種糙米籽粒鋅肥利用率的影響

籽粒鋅肥利用率是評價鋅肥利用率的重要指標。高CO2濃度對不同水稻品種糙米籽粒鋅肥利用率的影響見圖6。結果表明：供試品種糙米籽粒鋅肥利用率變幅為0.9%～10.1%，品種間存在顯著差異；其中武運粳27糙米籽粒鋅肥利用率最低，甬優1540最高。高CO2濃度使糙米籽粒鋅肥利用率平均降低1.5個百分點，降幅為26.2%；從不同品種看，高CO2濃度使揚稻6號和隆兩優1988糙米籽粒鋅肥利用率分別顯著降低84.0%和65.4%，而其他品種變化不顯著，表現為CO2與品種之間存在微弱的互作效應（P＜0.1）。

3 討論

本研究發現，FACE條件下大氣CO2濃度升高200μmol·mol?1使9個供試水稻品種產量平均增加15.7%，增產幅度與前人整合分析結果基本一致[26?27]。水稻屬于C3作物，高CO2濃度下C3作物顯著增產主要是與碳同化速率提高以及氣孔導度下降導致水分利用率增加有關[26]。此外，利用13C同位素標記研究發現，CO2濃度升高還可以使光合產物向籽粒轉移的速度加快，從而增強作物的結實能力[28]。與CO2的增產效應不同，葉面施鋅對水稻產量多無顯著性影響[5，17，22]，但也有潛在缺鋅土壤上水稻葉面施鋅使水稻增產的報道[29?31]。本研究花后葉面施鋅對水稻產量沒有顯著影響，且各品種趨勢基本一致（品種與鋅沒有互作），這與前人報道的在非缺鋅土壤上葉面施鋅對水稻[22]和小麥[32]無明顯增產效應的結果相符合。

對于CO2濃度升高對稻米鋅元素濃度的影響，與前人得出的結果并不一致，多數報道鋅濃度下降[12]，但也有一些研究發現植物鋅濃度并沒有顯著下降。例如，開放式大田研究發現，大氣CO2濃度升高對稻米籽粒鋅濃度無顯著影響[33]。這可能與各試驗中植物、土壤和環境因素的不同有關。本研究9個水稻品種的結果表明，全生育期高濃度CO2處理對糙米鋅濃度的影響總體并未達到顯著水平（P=0.077）。最近的一個水稻FACE研究綜合了中日兩國的試驗發現，盡管總的CO2效應達到顯著，但18個水稻品種中有10個品種的稻米鋅濃度無顯著變化[8]。因此，大氣CO2濃度升高對稻米鋅營養的影響與供試品種密切相關，確切結論可能還需要更多試驗的檢驗。

葉面施鋅使水稻[14]、小麥[34]和玉米[35]等作物籽粒中鋅濃度顯著增加。前人研究一致表明，花后葉面施鋅肥是實現水稻籽粒鋅濃度較大增幅的重要措施[17，20]。這可能與種子發育過程中鋅積累的模式有關，水稻開花之后的2周，籽粒鋅積累迅速增加[36]。本研究中，花后葉面施鋅使糙米鋅濃度由24.9 mg·kg?1顯著增加至34.2 mg·kg?1，增幅達37.3%，與前人研究一致。葉面施鋅能有效提高籽粒鋅濃度可能與鋅元素在韌皮部中的轉運效率較高有關。Nishiyama等[37]于水稻籽粒灌漿早期在劍葉施用65Zn，發現鋅主要通過韌皮部進入籽粒。Erenoglu等[38]在小麥研究中采用65Zn同位素標記手段，發現在缺鋅條件下，鋅很容易通過韌皮部從老的葉片和根轉移到幼嫩的葉片和根中，改善缺鋅小麥的營養狀況。

籽粒鋅濃度增幅與鋅肥濃度、氣候條件及水稻基因型等有關。付力成等[29]利用兩優培九和嘉花1號進行田間試驗，噴施0.1%的ZnSO4使兩品種精米鋅濃度分別顯著增加了21.6%、25.0%；噴施0.2%的ZnSO4分別使兩品種精米鋅濃度顯著增加了69.7%、41.7%。本研究9個品種同年同地的試驗發現，不同品種糙米鋅濃度對葉面鋅處理的響應是不同的，表現在鋅處理與品種間互作達顯著水平。進一步相關性分析發現，這種增幅差異可能與不同水稻品種本身的鋅濃度差異有關。葉面施鋅后糙米鋅濃度的增幅與其對照（未施鋅）水稻籽粒的鋅濃度呈顯著負相關（r=?0.655**，n=54），說明本身鋅濃度較低的品種，葉面施鋅效果更好。鋅含量不同的水稻品種對葉面施鋅的響應差異使篩選和培育高產富鋅水稻成為可能。

植酸是種子中磷的主要儲存化合物，以球狀體的形式在蛋白貯藏液泡中積累，主要分布在水稻籽粒的糊粉層[39]。植酸是種子中天然存在的鋅營養限制物質，其與鋅離子結合，降低了鋅的生物有效性，抑制了鋅在人體內的消化和吸收[3]。大氣CO2濃度升高對作物植酸濃度影響的研究較少。Myers等[12]通過對18個水稻品種的整合分析發現，高濃度CO2使稻米植酸濃度平均僅增加1.2%，未達顯著水平。本研究也得到與前人相同的結論，大氣CO2濃度升高使所有品種稻米植酸濃度增加1.1%，統計上未達顯著水平。葉面施鋅對作物籽粒植酸濃度的影響，不同作物研究結果并不一致。例如，對小麥[3]和大田豌豆[40]的研究發現葉面施鋅使籽粒植酸降低。對水稻的研究發現，多數情形下，葉面施鋅對稻米植酸的影響較小[13?14，22]。本研究中葉面施鋅處理對糙米植酸濃度無顯著影響且品種與鋅處理間無互作，說明葉面施鋅不會對糙米植酸濃度產生影響，所有供試品種間趨勢一致。

能被人體利用的鋅占攝入總鋅的比例稱為鋅的生物有效性，通常用植酸與鋅摩爾比來表示。大氣CO2濃度升高對水稻籽粒鋅生物有效性的影響研究不多，結果多表現為降低或沒有變化[9]。前期單一品種的FACE試驗發現，CO2濃度升高使Ⅱ優084稻米植酸與鋅摩爾比增加[13]，但對武運粳23沒有影響[14]。高濃度CO2使本研究中9個供試品種糙米植酸與鋅摩爾比略降低，但未達顯著水平。進一步方差分析表明，CO2處理與供試品種或鋅處理之間均無互作效應，說明本試驗條件下稻米生物有效性對CO2的響應不受品種和葉面施鋅的影響。從鋅處理效應看，花后葉面施鋅使稻米植酸與鋅摩爾比平均值顯著降低29.1%，與前人在水稻[22]和小麥[32]上的報道一致。相關性分析發現，葉面施鋅后糙米鋅濃度的增幅和糙米植酸與鋅摩爾比的降幅呈顯著正相關（r=0.729**，n=54），說明糙米鋅濃度增加是導致鋅有效性增加的主要原因。

籽粒鋅肥利用率是評價鋅肥利用效率的重要指標，前人研究發現葉面施鋅的鋅肥利用效率大于土壤施鋅[17，41]。小麥土壤施鋅的鋅肥利用效率不到1%，但葉面施鋅的鋅肥利用效率可達8%以上[18]。本研究供試品種在環境CO2濃度下糙米鋅肥利用率平均為5.7%，高CO2濃度下降至4.2%，平均降幅達26.2%。這一現象可能與高CO2濃度下水稻葉片氣孔導度下降有關[26?27]。有研究發現，葉片氣孔導度與葉面施鋅效果密切相關，氣孔導度大有利于葉面施鋅后籽粒鋅增加[21]。水稻葉片氣孔的張開有利于空氣中的微小顆粒附著在氣孔壁上，微小顆粒的存在有助于極性液體對氣孔的浸潤，使極性液體通過氣孔進入葉片內部的過程更加順暢，因此利于葉面鋅肥的吸收[42]。大氣CO2濃度升高對水稻籽粒鋅肥利用率的影響品種間差異顯著，總體而言秈型水稻的降幅（?47.9%，P=0.044）明顯大于粳型水稻（?5.9%，P=0.826），其中揚稻6號和隆兩優1988的籽粒鋅肥利用率降幅最大，分別達到84.0%和65.4%（圖6）。大氣CO2濃度升高條件下水稻籽粒鋅肥利用率下降顯著的水稻品種均為秈型水稻，可能與秈型水稻在高CO2濃度下氣孔導度下降較大有關，Wang等[27]整合分析結果顯示，秈稻品種高CO2濃度下氣孔導度降幅約為粳稻2倍（30.1%vs15.2%）。

4 結論

（1）水稻從移栽至成熟期大氣CO2濃度升高200 μmol·mol?1處理增加了稻米產量，但是對稻米的鋅營養影響較小。

（2）水稻花后葉面施鋅明顯改善稻米的鋅營養水平，表現在糙米鋅濃度和鋅有效性顯著增加，但增幅因品種而異。

（3）高CO2濃度使秈型水稻揚稻6號和隆兩優1988鋅肥利用率顯著下降，但對其他水稻品種鋅肥利用率影響較小。