雙酚A熒光檢測方法的建立及應(yīng)用

汪海洋，江姍姍，徐龍華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安271018）

雙酚A（Bisphenol A），結(jié)構(gòu)式如圖1 所示，化學(xué)式為C15H16O2，學(xué)名為2，2-二（4-羥基苯基）丙烷，簡稱二酚基丙烷。

圖1 雙酚A 的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of bisphenol A

雙酚A 是一種重要的有機(jī)化工原料，主要用于生產(chǎn)環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯等多種高分子材料，是目前中國需求量增長最快的化工產(chǎn)品之一[1]，其作為功能單體可以使材料無色透明、輕巧耐用和防沖擊[2]，在合成過程中不完全的聚合反應(yīng)，及后續(xù)使用過程中的分解，都可能導(dǎo)致雙酚A 單體殘留，進(jìn)而遷移到環(huán)境和食品中[3]。由于環(huán)境的污染，使得雙酚A 無處不在，從礦泉水瓶、醫(yī)療器械到食品包裝的內(nèi)里，都有它的身影[4-5]。雙酚A 作為典型的環(huán)境激素類物質(zhì)，長時間低劑量暴露，會對人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等構(gòu)成危害，甚至存在誘發(fā)癌癥的風(fēng)險[6-9]，因此，雙酚A 的檢測倍受關(guān)注，推動著其檢測技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展。

目前，雙酚A 的各種檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附法[10-12]、熒光分光光度法、電化學(xué)分析法[13]、氣相色譜法、高效液相色譜法[14]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)法[15]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16-17]均已建立。其中熒光檢測以其操作簡單、靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)時間短等優(yōu)勢，成為開發(fā)雙酚A 快速精準(zhǔn)檢測方法的首選。針對雙酚A的熒光檢測方法可以分為兩大類，一類是利用雙酚A自身熒光特性所建立的檢測方法，另一類是通過引入熒光染料、量子點、金納米顆粒等外源性熒光信號物質(zhì)，基于雙酚A 與外源性物質(zhì)熒光信號之間的相互作用而建立的檢測方法。

1 基于雙酚A 自身熒光特性建立的檢測方法

1.1 熒光分光光度法

熒光分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子吸收光譜和熒光光譜能級躍遷機(jī)理進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測定的方法[18]。雙酚A 分子存在共軛體系，在特定波長光激發(fā)后能產(chǎn)生熒光，從而對其進(jìn)行定量檢測。唐舒雅等[19]基于在pH 1 的酸性介質(zhì)中，利用β-環(huán)糊精對雙酚A 熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)作用，建立了水樣中雙酚A 殘留檢測的熒光分光光度法，該法的線性范圍為0.4 μg/L ～300.0 μg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%，檢出限為0.020 μg/L，并應(yīng)用該方法于聚碳酸酯膜（polycarbonate，PC）浸泡水樣中雙酚A 殘留量測定。余宇燕等[20]采用β-環(huán)糊精包被雙酚A，由于β-環(huán)糊精具有的疏水性內(nèi)腔可以減少雙酚A分子旋轉(zhuǎn)自由度及水的松弛效應(yīng)，避免外界空氣、水、離子對產(chǎn)生的熒光單重態(tài)的干擾，從而使雙酚A 熒光量子產(chǎn)率增大，實現(xiàn)了食品包裝材料中雙酚A 熒光定量檢測，在pH 4，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為282 和318 nm 時，該方法的檢出限為0.2 μg/L，線性范圍為1 μg/L ～10 μg/L，回收率為98%～102%。

1.2 高效液相色譜-熒光檢測法

高效液相色譜是目前有機(jī)物分析的常用方法，由于熒光檢測的靈敏度要高于紫外，而雙酚A 本身具有熒光特性，因此高效液相色譜-熒光檢測在雙酚A 定性定量分析中得以廣泛應(yīng)用。葛宇等[21]以乙腈作為提取液，用超聲輔助提取的方式，采用ZORBAX SB-C18柱分離，熒光檢測器檢測，建立了罐頭食品中雙酚A和6 種雙酚A 二縮水甘油醚衍生物含量的高效液相色譜-熒光檢測法，該方法的檢出限在0.04 mg/L ～0.1 mg/L范圍內(nèi)。賴紅娟等[22]同樣采用超聲輔助提取，以甲醇-四氫呋喃（70∶30，體積比）作為提取液，建立了一次性紙杯中雙酚A 高效液相色譜-熒光檢測方法，雙酚A在0.5 mg/L～50.0 mg/L 線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.10%～5.20%，檢出限為0.05 mg/L。于杰等[23]采用高效液相色譜-熒光法對食品包裝材料中雙酚A 及雙酚S 的遷移量進(jìn)行測定，該方法在0.001 μg/L～0.100 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，并采用此方法研究了不同模擬液對食品包裝材料中雙酚A 和雙酚S 遷移量及遷移特性。Tu等[24]等采用糖化輔助液-液萃取前處理與高效液相色譜-熒光法測定相結(jié)合，開發(fā)了復(fù)雜基質(zhì)—蜂王漿中雙酚A 和雙酚B 的同時分析方法，該方法對兩種物質(zhì)的最低檢出限為16、18 μg/kg，平均添加回收率為88.32%～93.59%、95.14%～97.48%。Li 等[25]設(shè)計合成了新型復(fù)合材料金屬有機(jī)骨架/殼聚糖/聚氧乙烯復(fù)合材料并以此作為吸附劑，開發(fā)了渦流輔助固相萃取流程，結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測方法，實現(xiàn)了塑料包裝的飲料和水中雙酚A 及其結(jié)構(gòu)類似物的檢測，該方法的線性范圍為0.1 mg/L ～20 mg/L，對雙酚A 的檢出限為0.019 μg/L。

此外，通過改進(jìn)樣品前處理設(shè)備，高通量、快速檢測方法也相繼被建立。Guo 等[26]利用DryLab 軟件建立了一種基于高效液相色譜-熒光檢測（high performance liquid chromatography fluorescence detector，HPLC -FLD）方法，對分離孔進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計，快速測定罐頭食品中雙酚A 及其衍生物，在包括平衡時間在內(nèi)的5 min內(nèi)實現(xiàn)了充分的分離，雙酚A 檢出限為0.01 μg/kg，分析回收率為70.46%～103.44%。Lopes 等[27]將一種中空纖維再生液膜萃取與96 孔板體系相結(jié)合，采用高效液相色譜-熒光和二極管陣列檢測，實現(xiàn)了水樣中雙酚A、4-壬基酚、對辛基苯酚、叔辛基苯酚、對羥基苯甲酸甲酯、羥苯乙酯的高通量分析檢測，其對雙酚A 的檢出限可達(dá)8 μg/L。

1.3 熒光光譜與統(tǒng)計學(xué)結(jié)合分析方法

隨著分析數(shù)據(jù)日益復(fù)雜，傳統(tǒng)的分析手段已經(jīng)不能滿足復(fù)雜分析的需求，熒光光譜技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)、統(tǒng)計學(xué)相結(jié)合成為實現(xiàn)復(fù)雜體系中雙酚A 準(zhǔn)確分析的重要手段，得到各國學(xué)者的廣泛認(rèn)可。Spagnuolo等[28]將化學(xué)計量學(xué)二階校正法與激發(fā)-發(fā)射矩陣熒光光譜相結(jié)合，采用平行因子法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立了非分離、簡便、快速的雙酚A 光譜熒光測定方法，實現(xiàn)了聚碳酸酯杯中雙酚A 遷移量的測定，該方法的具有較寬的線性范圍0～720 μg/L。Chen 等[29]也采用激發(fā)-發(fā)射矩陣熒光光譜與化學(xué)計量學(xué)二階校正方法相結(jié)合，實現(xiàn)了聚碳酸酯塑料中雙酚A 和碳酸二苯酯2 種組分的同時測定，該方法對兩種物質(zhì)的最低檢出限分別為0.04、1.18×103μg/L，平均添加回收率分別為99.35%和83.50%。

1.4 便攜式遠(yuǎn)程實時熒光檢測方法

便攜式遠(yuǎn)程檢測平臺的搭建，對于環(huán)境及其他介質(zhì)中雙酚A 污染暴露水平的快速檢測和實時監(jiān)測均具有重要意義。Long 等[30]構(gòu)建了便攜式、自動化熒光微陣列生物傳感平臺（fluorescence microarray biosensing platform，F(xiàn)MB），通過光纖開關(guān)的控制，在時間分辨效應(yīng)的基礎(chǔ)上，借助激發(fā)光源和光電二極管探測器可實現(xiàn)對于雙酚A 的四通道并行熒光檢測，其檢出限為0.03 μg/L。此外，隨著智能設(shè)備的發(fā)展和普及，有研究者將將熒光光譜與智能手機(jī)端相結(jié)合應(yīng)用于水樣中雙酚A 的檢測[31]，效果理想。

2 基于外源性熒光物質(zhì)檢測雙酚A 的方法

利用雙酚A 與外源性熒光物質(zhì)之間的熒光響應(yīng)行為，是目前實現(xiàn)雙酚A 熒光檢測的常用手段。隨著材料學(xué)的發(fā)展，外源性熒光物質(zhì)也從最初的熒光染料發(fā)展到現(xiàn)在的量子點、碳點、金納米顆粒、上轉(zhuǎn)換納米顆粒等，帶動了雙酚A 的熒光檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和完善。

2.1 基于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料的熒光檢測

常用的有機(jī)熒光染料標(biāo)記物是熒光素類以及羅丹明類染料。和熒光素相比，羅丹明類標(biāo)記物的熒光產(chǎn)率較小，但其發(fā)射波長較長，樣品背景干擾較小[32]。王廣軍等[33]基于酸性介質(zhì)中雙酚A 對溴酸鉀氧化丁基羅丹明B 熒光猝滅具有抑制作用，建立了抑制動力學(xué)熒光法測定痕量雙酚A。方法的線性范圍0.08 mg/L～0.88 mg/L，檢出限為0.005 mg/L，回收率在95%～103%之間。該方法可應(yīng)用于嬰幼兒奶瓶、假牙和地表水中雙酚A 含量的測定。

為了提高熒光探針對雙酚A 的選擇性，Li 等[7]等使用熒光染料AHN 標(biāo)記適配體，利用核酸適配體與目標(biāo)物的高親和力和強(qiáng)特異性，結(jié)合磁性納米顆粒的快速分離優(yōu)勢，建立了磁響應(yīng)核酸適配體熒光探針，應(yīng)用于實際環(huán)境水樣中雙酚A 的高選擇性靈敏檢測，其檢出限為強(qiáng)特異性0.047 μg/L。Hu 等[34]基于熒光素標(biāo)記的雙酚A 適配體與磁性氧化石墨烯之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），開發(fā)了雙酚A 高選擇性“turn-on”型熒光檢測方法。磁性氧化石墨烯（magnetismgrapheneoxide，MGO）可吸附熒光素標(biāo)記的雙酚A 適配體形成復(fù)合物，從而有效地抑制熒光素的熒光。而在雙酚A 存在的情況下，抗雙酚A 適配體會傾向于改變其構(gòu)型與雙酚A 靶標(biāo)結(jié)合，從而在MGO 表面脫附，然后通過磁分離使體系熒光恢復(fù)。該生物傳感器具有較強(qiáng)的抗干擾能力和靈敏度，檢測限為0.071 μg/L，線性范圍為0.2 μg/L ～10 μg/L。

2.2 基于半導(dǎo)體量子點（quantum dots，QDs）的熒光檢測

與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，量子點具有明顯優(yōu)勢，如可調(diào)的寬吸收光譜、窄而對稱的發(fā)射光譜等，廣泛應(yīng)用于熒光成像和化學(xué)傳感領(lǐng)域。通常采用表面功能化修飾，來提高量子點探針的選擇性和靈敏度，使其可以廣泛的應(yīng)用于不同需求的領(lǐng)域。基于雙酚A 對探針的熒光猝滅效應(yīng)，Kuang R 等[35]采用半胱胺修飾CdTe QDs 作為探針，建立了奶瓶中痕量雙酚A 熒光猝滅測定方法；Kadam 等[36]用環(huán)糊精功能化ZnO QDs，用于雙酚A 的選擇性檢測，其檢出限為0.19 μg/L（低于水生生物群的毒性限值），可滿足實際檢測需求；Cao 等[37]制備了殼聚糖修飾的硫化鋅量子點ZnS QDs，建立了水和塑料中雙酚A 的定量檢測方法，該法線性范圍為0.50 μg/L ～300 μg/L，檢出限為0.08 μg/L。此外，采用分子印跡技術(shù)替代表面修飾，也成為制備高選擇性和特異性熒光探針的通用方法。Kim 等[38]以分子印跡聚合物包被硒化鎘量子點CdSe QDs 作為熒光探針，借助分子印跡聚合物對目標(biāo)物分子的特異識別性能，實現(xiàn)了雙酚A 高選擇性傳感檢測，與其結(jié)構(gòu)類似物相比對雙酚A 具有更大的猝滅常數(shù)。Zhang 等[39]將羧基功能化的磁性納米顆粒與巰基乙胺包封的Mn2+摻雜的ZnS量子點偶聯(lián)，結(jié)合分子印跡技術(shù)合成了磁性核-殼型熒光探針（FeOx/ZnS@MIPs），對雙酚A 的檢出限為0.362 6 μg/L。

2.3 基于碳點（carbon dots，CDs）的熒光檢測

碳點是人們在碳納米材料中發(fā)現(xiàn)的一種具有量子點特性的球狀顆粒，具有獨(dú)特的光學(xué)特性、良好的生物相容性、低毒性，易于制備且耐光漂白[40]，因其優(yōu)異的性質(zhì)近年來得到迅速發(fā)展。在食品檢測領(lǐng)域，通常被用來制作各種熒光探針以及傳感器，任悅等[41]制備了碳點修飾的硅膠顆粒SiO2@CDs，基于雙酚A 對KBrO3氧化碳點而導(dǎo)致熒光猝滅的抑制作用，建立了檢測雙酚A 的方法，檢出限為5.2 μg/L，并成功用于塑料制品中雙酚A 的測定。為了降低基質(zhì)干擾，實現(xiàn)樣品中雙酚A 的特異性檢測，通常引入分子印跡聚合物來提高方法的選擇性，Liu 等[42]采用原位水熱合成法制備了分子印跡聚合物基體包覆碳點的熒光生物傳感器，并基于此傳感器成功建立了一種雙酚A 的熒光檢測方法，方法檢測限為30 nmol/L，成功應(yīng)用于河流水樣的檢測。Wang 等[43]基于適配體的特異性識別和AuNPs 對氮摻雜碳點的熒光的抑制作用，建立了一種快速簡便、低成本的雙酚A 檢測方法，方法檢出限為3.3 nmol/L，并成功應(yīng)用于自來水樣品中的雙酚A檢測。氮摻雜碳點對環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)有效，具有優(yōu)異的光致發(fā)光性能，通過摻雜和功能化能夠改變其光學(xué)性質(zhì)，提高量子產(chǎn)率，同樣可應(yīng)用于雙酚A 檢測領(lǐng)域[44]。

2.4 基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒的熒光檢測

傳統(tǒng)的下轉(zhuǎn)換熒光材料的發(fā)光過程是將高頻激發(fā)光轉(zhuǎn)為低頻發(fā)射光，發(fā)出的能量小于吸收的能量，可能會導(dǎo)致發(fā)光效率低、靈敏度低等問題，為了解決這些問題，可以制備具有強(qiáng)熒光效率的上轉(zhuǎn)換納米粒子來替代傳統(tǒng)的熒光粒子，而且上轉(zhuǎn)換納米粒子可以進(jìn)行定量修飾，更加拓寬了它的應(yīng)用范圍。Li 等[45]采用了一種修飾了的上轉(zhuǎn)換納米顆粒（up conversion nanoparti cles，UCNPs）與四甲基羅丹明之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，建立了一種用于痕量雙酚A 檢測的超靈敏傳感器，在最佳檢測條件下，547 nm 處UCNPs 的峰值強(qiáng)度與雙酚A 濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，檢測限為0.05 ng/mL，自來水、河水和一次性紙杯水的回收率一般在91.0%～115.0%之間。為了進(jìn)一步縮短檢測時間，簡化操作步驟，Sheng 等[46]使用抗雙酚A 抗體偶聯(lián)羧基功能化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒作為信號探針，包被抗原共軛羧基功能化的磁性聚苯乙烯微球作為捕獲探針，建立了一種靈敏的熒光免疫分析法來檢測桶裝飲用水以及瓶裝礦泉水中的雙酚A，水樣中雙酚A 的檢出限為0.02 μg/L。

2.5 基于雙發(fā)射熒光檢測

目前，大多數(shù)熒光探針都是通過單發(fā)射信號的熒光響應(yīng)變化來達(dá)到檢測的目的，但這種單一的信號變化很容易受到外部因素的干擾，所以近年來一些熒光校正的方法得到了快速的發(fā)展，比如利用探針的雙發(fā)射熒光可對比的特性進(jìn)行校正，Xiang 等[47]提出了一種簡單有效的熒光納米傳感器的設(shè)計方法，在染料摻雜的二氧化硅納米顆粒表面涂覆碳點，制備了雙酚A 雙發(fā)射納米傳感器。雙發(fā)射二氧化硅納米粒子的熒光在鹽酸中被溴酸鉀氧化猝滅（雙酚A 抑制KBrO3氧化，導(dǎo)致雙發(fā)射二氧化硅納米顆粒的比色熒光反應(yīng)），基于此效應(yīng)，建立了一種雙酚A 熒光檢測方法，其檢出限為0.80 ng/mL，該方法已成功應(yīng)用于不同塑料制品浸出液中雙酚A 的測定。比色熒光傳感器的構(gòu)建往往涉及繁瑣的制備過程或者復(fù)雜的修飾過程，雙發(fā)射熒光納米粒子的出現(xiàn)則大大簡化了傳感器的制備過程及修飾過程，Lu 等[48]研究了一種基于雙發(fā)射納米顆粒（dual emission nanoparticles，D-NPs）的比率熒光分子印跡傳感器用于雙酚A 的檢測，該納米顆粒由碳點和金納米團(tuán)簇組成，提高了傳感器的靈敏度，其檢測限為29 nmol/L，并成功用于水樣、罐頭食品以及塑料制品中雙酚A 的檢測。

3 展望

現(xiàn)有雙酚A 常用的檢測分析方法雖然精準(zhǔn)化、多樣化，但是在簡便性和快捷性方面還有待進(jìn)一步提高，比如實驗室多用色譜法來檢測雙酚A，但色譜法需要繁瑣的前處理過程，檢測周期較長，檢測成本較高，且不適用于現(xiàn)場快速檢測。熒光檢測方法使用儀器簡單，檢測靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)時間短，是一種經(jīng)濟(jì)有效的檢測方法，現(xiàn)有的熒光檢測技術(shù)慢慢突破了傳統(tǒng)熒光技術(shù)的限制，如上轉(zhuǎn)換納米材料可以將低能光轉(zhuǎn)化為高能光，與下轉(zhuǎn)換熒光納米材料相比，解決了發(fā)光效率低、靈敏度低等問題；雙發(fā)射熒光的此消彼長特性可以進(jìn)行熒光的自我校正，大大降低了外部因素對熒光信號的干擾，其他熒光檢測方法的有效改進(jìn)也在穩(wěn)步進(jìn)行，相信熒光檢測法在雙酚A 的檢測領(lǐng)域中會有巨大的發(fā)展前景。