RhoA在乳腺癌中的表達及與淋巴管生成、淋巴結轉移的關系

王鵬，王遵義，邵建強，張勤，張輝

(滄州市中心醫院甲狀腺乳腺外三科，河北 滄州 061000)

乳腺癌是婦女最為常見的惡性腫瘤之一，且發病率逐漸上升，大部分死亡均因癌細胞發生轉移所引起，其中最主要的轉移方式為淋巴道轉移，故而對乳腺癌患者的淋巴道轉移進行控制可以有效降低乳腺癌致死率[1-2]。Rho蛋白是一種小分子蛋白，具有一定程度的酶活性，在細胞增殖和分裂過程中有重要的生物學作用，一般通過下游靶效應對細胞骨架活動進行調節，對細胞變形轉移具有重要開關作用[3-4]。研究[5]顯示，腫瘤的發生、發展與Rho蛋白存在一定相關性，主要包括新生血管形成、轉移和侵襲細胞凋亡以及腫瘤增殖和生長等。RhoA作為Rho家族蛋白一員，在多種腫瘤組織高水平表達，并與腫瘤惡性程度關系密切，在腫瘤轉移及發生中起著重要的作用[6]。本研究探討RhoA在乳腺癌中的表達及與淋巴管生成、淋巴結轉移的關系，分析其潛在臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇滄州市中心醫院2016年3月至2019年12月收治的140例乳腺癌患者和70例纖維瘤患者作為研究對象，收集其手術切除石蠟標本，其中乳腺癌患者年齡(47.85±3.21)歲。按照臨床分期[7]為Ⅰ期46例、Ⅱ期62例、Ⅲ期20例和Ⅳ期12例。本研究經本院倫理委員會批準執行，所有患者均同意并簽署知情協議書。納入標準：其中乳腺癌組患者均經病理學檢驗明確診斷者，且排除合并嚴重心肝腎功能障礙者，所有患者及家屬同意并簽署知情協議書者；乳腺纖維瘤符合乳腺纖維腺瘤診治專家共識[8]中的相關診斷標準。排除標準：排除妊娠哺乳期患者，合并心肝腎功能障礙者；排除凝血功能障礙者；依從性差，中途退出者。

1.2 儀器和試劑

電熱恒溫水浴箱(北京市醫療設備廠)、烘片機、石蠟切片機、漂烘處理儀、包埋機以及脫水機(德國LEICA)，顯微鏡(OLYMPUS)。氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(貨號SK2020)均購于上海科順生物科技有限公司，濃縮型抗人RhoA單克隆抗體(貨號TL-102)購于北京科昕生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 資料收集 收集乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、ER、PR、HER-2、臨床分期等相關資料。

1.3.2 免疫組織化學染色 采用S-P法對患者標本RhoA表達情況進行測定[9]，采用常規的脫蠟和水化操作對石蠟切片進行處理，之后通過pH6.0的高壓檸檬酸鹽緩沖液對其抗原進行修復處理。將下邊同業進行依次滴加處理，具體如下：過氧化酶阻斷液、非免疫性動物血清，分別在室溫條件下孵育10 min，100 mL的第一抗體(堿性磷酸酶標記的羊抗鼠一抗)，之后室溫條件下孵育60 min，第二抗體(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗)、鏈菌素抗生素-過氧化物酶溶液，分別在室溫條件下孵育10 min，最后將DAB顯色劑(新鮮配置)滴加其中，顯色5 min。并在顯微鏡下進行染色觀察。通過自來水進行沖洗、蘇木素進行復染、脫水和透明處理，并進行中性樹膠封片處理。

1.3.3 判斷結果 采用改良后的Tanaka定量計分法進行結果判定[10]，采用具有代表性的5個視野區域，在200倍鏡下進行陽性細胞的計數和顯色強度判定，其中陽性細胞百分率不小于75%為4分，50%～75%為3分，25%～50%為2分，5%～5%為1分，陽性細胞百分率不超過5%，為0分。顯色強度棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，未著色為0分，兩項相乘，即可得計算平均值。按照得分情況將其分為4個等級，其中>9分為強陽性(+++)、5～8分為中度陽性(++)、2～4分為弱陽性(+)、0～1分為陰性(-)，其中>1分可判定為陽性，≤1分判定為陰性。

1.3.4 淋巴管的判定和計數方法 參考Weidner推薦的方法對其淋巴管計數和判定進行分析[11]，被染成棕黃色的內皮細胞簇或者單個內皮細胞連成的不閉合或者閉合的線狀管腔，即可作為一個可以計數的微淋巴管，被確定的首先要在200倍顯微鏡下進行微淋巴管密度(LMVD)最高區域的選擇，之后再在200倍顯微鏡下選擇5個顯微視野，淋巴管密度(LVD)值即為計數平均值/鏡下面積(0.74 mm2)。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 RhoA的表達分布及LVD值水平分析

纖維瘤標本陰性表達，見圖1。乳腺癌患者RhoA陽性表達，見圖2。乳腺癌患者RhoA表達的陽性率和LVD值均高于纖維瘤患者，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 RhoA的表達分布及LVD值水平分析

2.2 乳腺癌組織中的LVD與RhoA表達的相關性

經Spearman相關性分析顯示，乳腺癌組織中的LVD與RhoA表達呈現正相關(r=0.315，P=0.004)。

2.3 乳腺癌組織中的RhoA表達與其臨床病理參數的關系

乳腺癌組織中的RhoA表達與其年齡、腫瘤大小、孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)以及HER-2無相關性，與淋巴結轉移(r=0.783，P<0.001)和臨床分期(r=0.654，P<0.001)呈現正相關。見表2。

表2 乳腺癌組織中的RhoA表達與其臨床病理參數的關系[n(%)]

3 討論

Rho蛋白家族是一種具有細胞內分子開關功能的GTP酶[10-12]，可以在細胞外信號的強烈刺激下，與鳥苷酸結合并水解，使其在失活性(結合GDP)與活性型(結合GTP)之間循環[13]。而對肌動蛋白細胞骨架的調節是Rho蛋白家族的重要功能，另外，在調控細胞增殖、凋亡及惡性腫瘤細胞轉移或浸潤等方面起著較為重要的作用[14]。Rho蛋白通過改變細胞骨架組裝，調控細胞遷移，進而影響腫瘤轉移的整個過程[15]。研究[11]顯示，RhoA蛋白是Rho蛋白家族成員之一，與腫瘤細胞的侵襲和遷移關系密切。Arnold等[16]研究顯示，與正常組織相比，結腸癌、乳腺癌及肺癌組織中RhoA蛋白的表達率相對較高。Wang等[17]認為，消化道腫瘤中RhoA蛋白的表達率明顯較高。

微血管密度是評估血管生成的“金標準”，即對新生血管數目采用免疫組化法進行檢測[18]。而本文將LVD作為評估淋巴管生成的重要指標。文中結果顯示，乳腺癌組織中存在一定量的新生淋巴管，而新生淋巴管的內皮存在相對較大的間隙，同時周圍的足細胞也相對較少；且與纖維瘤相比，乳腺癌組織中的LVD值較高[19]。這表明新生淋巴管對乳腺癌的遠處轉移及淋巴結的生成具有重要作用，而淋巴管數目的增加也提高了腫瘤細胞向管腔進入的風險[20]。 文中相關性結果提示RhoA蛋白的表達對腫瘤淋巴道轉移和淋巴管新生具有一定的促進作用。研究[21-22]顯示，RhoA蛋白的高水平表達還可一定程度刺激VEGF在腫瘤細胞株中的表達上調，對淋巴管新生的誘導效果還可被可溶性的VEGFR-3所阻斷，故而RhoA蛋白還可能通過對VEGF和VEGFR-3進行調節，進而間接性的促進淋巴管的生成。另外，與Ⅰ-Ⅱ期乳腺癌患者相比，Ⅲ-Ⅳ期患者的RhoA蛋白陽性表達率更高，表明其與乳腺癌的發生發展以及轉移關系較為密切。

綜上所述，乳腺癌中RhoA蛋白的表達可以促進乳腺癌淋巴管的新生，與淋巴結轉移、臨床分期以及LVD值均呈正相關，可為乳腺癌淋巴道的轉移抑制提供新的研究方向，具有一定的臨床應用價值。