聚(對氧環己酮-co-l-苯丙氨酸氮芥)納米顆粒用于乳腺癌移植瘤治療

蒲宇，馮成敏，王冰，董軍

(1.醫學影像四川省重點實驗室，川北醫學院附屬醫院；2.川北醫學院臨床醫學系耳鼻咽喉科；3.醫學影像四川省重點實驗室，川北醫學院基礎醫學院化學教研室；4.川北醫學院基礎醫學院化學教研室，四川 南充 637000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發病率僅次于肺癌[1]。隨著技術進步及對乳腺癌認知的不斷深入，越來越多的治療手段被應用于臨床，如輔助化療、免疫治療、靶向治療等[2]。l-苯丙氨酸氮芥，又名l-溶肉瘤素，為烷化劑，是目前仍應用于臨床的抗腫瘤藥物；主要作用于DNA，適用于治療多發性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌[3-4]。其鹽酸鹽可靜脈注射，但該藥物毒性較大，全身給藥容易造成多種毒副作用，且其分子在水相環境中極不穩定容易水解，導致藥物血液半衰期短，生利用率低[5-6]。因此，為了降低l-苯丙氨酸氮芥的毒副作用，提高其在水相環境中的穩定性和生物利用率，本文將l-苯丙氨酸氮芥結合于疏水大分子鏈上制備了適用于局部注射或局部植入給藥的l-苯丙氨酸氮芥大分子前藥納米顆粒，并探究了其對乳腺癌移植瘤的治療作用。該納米顆粒通過大分子鏈的折疊、纏繞可有效減少l-苯丙氨酸氮芥與水相環境的接觸從而減少其自發水解作用。且隨著大分子的降解，l-苯丙氨酸氮芥被釋放至作用部位，從而提高藥物的生物利用率。另外，通過局部植入納米顆粒可保持藥物在病灶部位的局部高濃度，從而降低藥物的全身性毒副作用。

1 材料與方法

1.1 試劑、細胞及動物

L-苯丙氨酸氮芥(l-melphalan，成都艾科試劑)，對氧環己酮(PDO，北京伊諾凱試劑)，三光氣(北京伊諾凱試劑)，尼羅紅、辛酸亞錫(Sigma-Aldrich，美國默克)，戊巴比妥鈉(川北醫學院實驗動物中心)，DMEM、胎牛血清、雙抗(Life Technologies，美國)。

人乳腺癌細胞株MCF-7購于中國科學院細胞庫/干細胞庫。

體重為18～22 g SPF級裸鼠10只來源于川北醫學院實驗動物中心 【SCXK(川)2013-18】，雄性，操作在川北醫學院實驗動物中心進行【SYXK(川)2013-076】，實驗過程對動物的處置符合相關動物倫理學要求。

1.2 實驗方法

聚(對氧環己酮-co-l-苯丙氨酸氮芥)(PDCM)大分子前藥、PDCM納米顆粒(PDCM NP)、聚對氧環己酮(PPDO)納米顆粒、尼羅紅標記PDCM靜電噴霧納米顆粒均按照本課題組先前報道的方法制備[7]。納米顆粒信息如表1所示。

表1 PDCM大分子前藥信息及其納米顆粒平均粒徑

MCF-7細胞接種于96孔板(2.5 ×103/孔)加入正常培養基貼壁12 h后，吸出原有培養基，分別加入正常培養基及含PDCM-1 NP、PDCM-2 NP、PDCM-3 NP和PPDO NP的培養基(納米顆粒經環氧乙烷事先滅菌，濃度為200 mg/L，培養基含89% DMED，10%胎牛血清，1%雙抗)，5% CO2，37 ℃培養1、3、5、7 d后加入CCK-8 培養4 h后將孔板置于酶標儀，450 nm檢測各孔吸光度(6復孔/組/時間點)。MCF-7細胞接種于96孔板(2.5 ×103/孔)加入正常培養基貼壁12 h后，吸出原有培養基，加入含200 mg/L尼羅紅標記PDCM-2 NP的培養基，5% CO2，37 ℃培養24 h后，DAPI染細胞核，置于倒置熒光顯微鏡下觀察PDCM NP被進入細胞情況。

將0.1 mL含107個MCF-7細胞的懸液注射于裸鼠右側腋窩部位皮下，構建裸鼠移植瘤模型。注射細胞懸液后均予以單籠飼養(20～25 ℃保暖)，腫瘤體積達80～100 mm3后進行瘤內給藥處理，記錄給藥前腫瘤體積并記為第0天。10只荷瘤裸鼠隨機均分為Control及PDCM-2 NP 兩組，Control組裸鼠瘤內注射0.1 mL生理鹽水，PDCM-2 NP組裸鼠瘤內注射0.1 mL含1 mg PDCM-2 NP的懸濁液。給藥第2、4、6、8、10、12、14、16、18及20天測量瘤體體積并記錄，并于第20天，采用頸椎脫臼法處死實驗裸鼠。同時，取下腫瘤組織，用4%中性甲醛溶液固定。對組織進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋處理后，切片。蘇木精-伊紅染色后于顯微鏡下腫瘤組織壞死及浸潤情況，TUNEL染色后觀察組織細胞凋亡狀況并用Image pro plus 軟件統計切片IOD值。

1.3 統計學分析

2 結果

PPDO NP及PDCM NP對MCF-7細胞增殖的影響如圖1所示，不含l-苯丙氨酸氮芥的PPDO NP與MCF-7細胞共培養1 d后表現出對細胞增殖的抑制作用，第3天及以后對細胞增殖無明顯抑制作用。PDCM NP在整個培養過程中均表現出對細胞增殖的抑制作用，且抑制效率與PDCM中所含的l-苯丙氨酸氮芥量成正比。PDCM NP對細胞增殖抑制的最高峰出現在培養第3天，第3天后PDCM NP對細胞增殖的抑制作用有所減弱。

紅色熒光標記的PDCM-2 NP與MCF-7細胞共培養24 h后，用DAPI對細胞核著色，后用熒光顯微鏡觀察，結果如圖2所示。納米顆粒紅色熒光區域與細胞核藍色熒光區域重疊程度極高，表明PDCM NP可被MCF-7細胞吞入細胞內部，這有助于l-苯丙氨酸氮芥在胞內的釋放。

圖3為對照組及單次瘤內注射PDCM-2 NP后MCF-7裸鼠移植瘤體積增長曲線，對照組裸鼠移植瘤體積在20 d內持續增長，至第20天增長到處理前體積的2倍。注射瘤內PDCM-2 NP的裸鼠移植瘤在20 d內體積無明顯變化，表明PDCM-2 NP可有效抑制MCF-7細胞裸鼠移植瘤的生長。腫瘤組織病理學相關檢查結果如圖4所示。由圖4A可見，與對照組相比，PDCM-2 NP處理的腫瘤可觀察到較多的壞死組織。由圖4B及圖4C可得，與對照組相比，PDCM-2 NP處理的裸鼠腫瘤組織TUNEL著色范圍更廣，深度更深，單位面積IOD值更高，這表明PDCM-2 NP處理的腫瘤組織中有更多凋亡的腫瘤細胞。可見PDCM-2 NP處理可導致腫瘤組織壞死、促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤增殖。

MCF-7裸鼠移植瘤生長至80～100 mm3；瘤內注射生理鹽水(Control)或PDCM-2 NP (PDCM-2)后腫瘤體積增長倍數=測得腫瘤體積(V)/處理前腫瘤體積(V0)(對照組腫瘤體積增長倍數與PDCM-2 NP處理組瘤體增長倍數差異具有統計學意義，P<0.05)。

3 討論

PDCM NP可在體外抑制人乳腺癌細胞株MCF-7的增殖。與MCF-7細胞共培養的第1天，PPDO也表現出對MCF-7細胞增殖的抑制作用，這是由于PPDO NP的加入影響了MCF-7細胞的貼壁，而培養后期細胞貼壁完成后這種抑制作用消失，表明PPDO NP本身不具有抑制MCF-7細胞增殖的作用。PDCM NP與MCF-7細胞共培養1 d對細胞增殖僅表現出輕微的抑制作用且抑制作用與PDCM所含l-苯丙氨酸氮芥的量成正比。抑制作用不顯著可能是因為共培養時間過短，PDCM未能及時降解以釋放出l-苯丙氨酸氮芥。但PDCM NP對細胞增殖的抑制作用與PPDO NP相比并無明顯差別，這可能是因為PDCM分子鏈中含有的酰胺鍵更有利于細胞黏附、貼壁。PDCM NP對MCF-7細胞增殖的抑制作用在與細胞共培養的第三天達到峰值，之后逐漸衰減，這可能是由于細胞貼壁完成后進入快速增殖階段時由PDCM NP降解而釋放的l-苯丙氨酸氮芥濃度過低。從PDCM NP抑制MCF-7細胞增殖的情況來看，在培養第3天抑制率可達到50%，由此推斷除了PDCM NP胞外降解釋放l-苯丙氨酸氮芥以抑制MCF-7細胞增殖外，可能還存在其他途徑導致l-苯丙氨酸氮芥被快速釋放并被有效應用。為此，本研究還制備了熒光標記的PDCM-2 NP，與DAPI染色的細胞核共定位來判斷PDCM是否可被癌細胞吞噬至胞內從而實現胞內釋放。結果顯示，PDCM NP確實可被癌細胞吞噬至胞內，并且極可能被溶酶體捕獲。這主要是因為含有大量酯鍵和肽鍵的PDCM使溶酶體內大量的酶加速降解，從而快速在胞內釋放l-苯丙氨酸氮芥以抑制細胞的增殖。

此外，PDCM NP體內抑制腫瘤細胞增殖的作用也在MCF-7裸鼠移植瘤模型中得以驗證。單次瘤內注射PDCM NP后腫瘤的增長受到明顯抑制，腫瘤體積在處理后的20 d內幾乎未發生明顯變化，這說明PDCM NP可在瘤內長時間抑制腫瘤的生長。這說明l-苯丙氨酸氮芥的結構得到了大分子前藥分子鏈的有效保護，且l-苯丙氨酸氮芥只能隨著PDCM NP在細胞外的水解或被癌細胞吞噬且酶解后才被釋放，即PDCM NP是l-苯丙氨酸氮芥的緩釋劑型。再者，移植瘤組織相關病理學檢測顯示PDCM NP對腫瘤增殖的抑制作用是通過促進腫瘤組織壞死、誘導腫瘤細胞凋亡而實現的。

綜上，PDCM NP可有效抑制MCF-7細胞體外增殖，且抑制作用的強弱與PDCM所含l-苯丙氨酸氮芥的量成正比。PDCM NP可被MCF-7吞噬至胞內從而實現l-苯丙氨酸氮芥的胞內釋放。作為l-苯丙氨酸氮芥的緩釋劑型，PDCM NP單次瘤內注射可較長期地抑制MCF-7細胞裸鼠移植瘤的增殖，并且這個抑制作用是通過促進腫瘤組織壞死及細胞凋亡而實現的。