不同產地車前草HPLC指紋圖譜及化學模式識別研究

（湖南省郴州市第一人民醫院藥劑科，湖南 郴州 423000）

車前草是車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥全草，具有清熱利尿通淋，祛痰，涼血，解毒的功效，用于治療熱淋澀痛，水腫尿少，暑濕泄瀉，痰熱咳嗽，吐血衄血，癰腫瘡毒等證[1]。車前草有廣泛的臨床用途、藥源豐富、廉價易得，含黃酮類、苯乙醇苷類、環烯醚萜類、三萜類等成分[2-3]，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面顯示出潛在的藥用價值[4-6]。其質量研究報道多為高效液相色譜（HPLC）法測定其若干活性成分的含量[7-12]，未見有相關指紋圖譜研究的文獻報道。本研究以江西、四川、江蘇、廣西、安徽5個產地16批車前草為研究對象，建立其指紋圖譜，通過相似度評價、聚類分析和主成分分析對其質量進行評價，旨在為車前草的合理利用和質量控制提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀，包括HPG-3x00A二元泵、Split-Loop自動進樣器、Chromeleon 7色譜工作站、PDA-3000二極管陣列檢測器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SP3-100AL超聲波清洗機（上海泗裴電子科技有限公司）；Mettler Toledo Xs205 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；QJ-02A 型粉碎機（上海兆申科技有限公司）。

1.2 材料

大車前苷，毛蕊花糖苷，異毛蕊花糖苷，木樨草苷，木犀草素，芹菜素對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度均≥98.0 %）；收集的16批樣品信息見表1。16批車前草藥材經貴州醫科大學藥學院鞏仔鵬教授鑒定，均為車前科植物車前 Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥全草。甲醇、乙腈為色譜純（美國 Tedia 公司），其他試劑均為分析純，水為純凈水。

表1 車前草藥材來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 %甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，10 %A；8～20 min，10 %A→15 %A；20～28 min，15 %A→25 % A；28～40 min，25 %A→40 %A；40～52 min，40 %A→55 %A；52～60 min，55 %A→10 %A；65～70 min，8 %A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：330 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取車前草藥材樣品粉末2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加70 %甲醇30 ml，稱定重量，超聲提取（功率：250 W，頻率：40 kHz） 30 min，放冷，再稱定重量，用70 %甲醇補足減失的重量，搖勻，經 0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素對照品適量，加70 %甲醇制成每1 ml分別含352.1，65.32，42.47，25.14，17.98 μg的混合對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取2.2項下供試品（樣品編號：S1）溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定 6次。以9號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，19個共有峰相對保留時間的RSD為0.12 %～0.38 %，相對峰面積的RSD為0.74 %～1.91 %，均小于 2.0 %（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取2.2項下供試品（編號：S1）溶液適量，分別于室溫下放置 0，6，12，20，30 h 時，按2.1項下色譜條件進樣測定。以9號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，19個共有峰相對保留時間的RSD為0.28 %～0.81 %，相對峰面積的RSD為0.98 %～1.81 %，均小于2.0 %（n=5），表明供試品溶液于室溫下放置30 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取車前草藥材樣品（編號：S1）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定。以9號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果19個共有峰相對保留時間的RSD為0.17 %～0.69 %，相對峰面積的RSD為0.74%～1.85 %，均小于2.0 %（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜測定及相似度分析 取16批藥材樣品（編號：S1～S16），按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將16批藥材的HPLC色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版），以 S1樣品圖譜為參考圖譜，時間窗寬度設為 0.1 s，中位數法生成對照指紋圖譜，其疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜詳見圖1、圖2。對16批藥材樣品（編號：S1～S16）進行相似度分析，結果表明，10批藥材樣品相似度在0.854～0.957之間，表明各批藥材主要化學成分較為一致。

圖1 16批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜

圖2 16批藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜

2.4.2 共有峰指認 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012年A版），對16批樣品的HPLC圖譜進行比較分析，16批樣品共有19個共有峰，其峰面積占色譜峰總面積的90 %以上，提示該方法可用于評價藥材的整體質量。在19個共有峰中，通過與對照品圖譜對比，并結合各峰的紫外吸收光譜，指認出4號峰為大車前苷、7號峰為毛蕊花糖苷、9號峰為異毛蕊花糖苷、11號峰為木樨草苷、14號峰為木犀草素、17號峰為芹菜素。混合對照品色譜圖和樣品色譜圖見圖3。9號峰的峰面積和保留時間適中，且分離度較好，可作為參照峰。各共有峰相對于參照峰的相對峰面積，見表2。

表2 16批藥材樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積

圖3 混合對照品色譜圖（A）、樣品色譜圖（B）

2.5 聚類分析

以14號峰為參照，以16批藥材樣品（編號：S1～S16）中19個共有峰的相對峰面積為變量，組成16×19階原始數據矩陣，采用SPSS 20.0軟件進行聚類分析，采用組間連接法，以歐式距離作為樣品的測度。結果，16批藥材樣品可聚為2類，S6～S9、S13、S14聚為一類，S1～S5、S10～S12、S15、S16聚為一類，見圖4。

圖4 聚類分析樹狀圖

2.6 主成分（PCA）分析

以9號峰為參照，以16批藥材樣品（編號：S1～S16）中19個共有峰的相對峰面積為變量，導入SIMCA 14.1軟件，進行PCA分析，模型自動擬合選擇2個主成分，其累積方差貢獻率為85.47 %，提示模型預測良好，見圖5。由圖5可知，16批藥材樣品可分為2 組，S6～S9、S13、S14為一組，S1～S5、S10～S12、S15、S16為一組，該結果與聚類分析結果一致。兩組車前草藥材存在產地交叉情況，因此，產地不能作為車前草質量優劣的唯一標準，需要綜合藥材各化學成分含量進行整體質量評價[13]。為了更好地考察不同產地車前草藥材成分差異的主要標志性成分，進一步采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）法對樣品進行分析。

圖5 16批藥材樣品的PCA得分圖

2.7 PLS-DA

PLS-DA主要原理是先利用PLS提取樣本的主成分，然后將主成分作為新變量建立訓練樣本自變量和分類變量之間的回歸模型，進行判別分析[14]。本研究對上述兩組樣品進行PLS-DA分析，繪制PLS-DA模型得分圖，見圖6。模型的主成分回歸系數Q2Y=0.645＞0.5，說明模型的預測能力較強，反映兩組樣本具明確分離的趨勢；R2Y=0.973，說明模型對因變量變異貢獻的百分比為 97.3 %，即自變量（共有峰）的變化能解釋導致97.3 %不同分類（因變量）發生，模型的擬合度較好[14]。通過VIP（variable importance）圖篩選出差異較大成分，見圖7。文獻指出[15]，VIP＞1的變量對分類起著關鍵作用。由圖 7可知4（大車前苷）、7（毛蕊花糖苷）、17（芹菜素）、14（木犀草素）、6號峰5個成分VIP值均大于1，對車前草藥材的質量影響較大。

圖6 16批藥材樣品的PLS-DA模型得分圖

圖7 16 批藥材樣品PLS-DA模型中共有峰的VIP值

3 討論

3.1 色譜條件及提取方法的選擇

本研究前期預試驗中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液（0.2 %，0.1 %）、乙腈-甲酸水溶液（0.2 %，0.1 %）、乙腈-乙酸水溶液（0.2 %，0.1 %）等不同流動相系統的分離效果。結果發現，以乙腈-0.1 %乙酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時，各峰分離度較好，且色譜峰保留時間適中。通過3D全波長掃描，發現檢測波長為330 nm時HPLC指紋圖譜色譜峰較多，基線平穩，特征峰信號較明顯，故選擇330 nm為檢測波長。比較超聲提取與加熱回流提取兩種提取方式，結果兩種提取方法的效果相當，考慮超聲提取操作簡單，因此選擇超聲提取，在此基礎上進一步考察提取時間和提取溶劑對HPLC指紋圖譜的影響，最終選擇用70 %甲醇超聲提取30 min。

3.2 化學模式識別結果分析

指紋圖譜相似度評價結果顯示，16批車前草藥材樣品的相度為0.854～0.957，表明不同產地車前草藥材質量相對穩定；聚類分析和PCA分析結果均顯示，16批車前草藥材樣品分為2類，S6～S9、S13、S14為一組，S1～S5、S10～S12、S15、S16為一組，分析結果表明不同產地的車前草藥材質量具有差異性，兩組車前草藥材存在產地交叉情況，故產地不能作為評價車前草藥材質量的唯一標準，藥材質量還受采收時間、土壤、降水量、溫度等其他因素影響，需要綜合整體化學成分的含量特征進行質量評價。通過PLS-DA分析找出影響車前草分類的5個差異性成分，并指認出其中4個影響較大的化學成分，即大車前苷、毛蕊花糖苷、芹菜素、木犀草素，提示車前草藥材中這4個成分受生長環境的影響較大，大車前苷和毛蕊花糖苷為車前草主要活性物質[11]，芹菜素、木犀草素為其黃酮類成分[7]，具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化等生理活性[6,16]，為車前草主要有效成分[7]，因此在判斷車前草藥材真偽和優劣時應對上述4個成分重點考察。

本研究采用HPLC指紋圖譜結合化學模式識別對不同產地車前草藥材進行質量評價，所建立的測定方法準確，穩定性好，靈敏度高，專屬性強，可為車前草藥材的質量控制和質量鑒別提供有效手段。