UPLC法同時測定阿托伐他汀鈣中15個雜質含量

（常州制藥廠有限公司，江蘇 常州 213000）

關健詞：超高效液相色譜法；阿托伐他汀鈣；有關物質

阿托伐他汀鈣是HMG-CoA還原酶的選擇性、競爭性抑制劑，能通過抑制肝臟內HMG-CoA還原酶和膽固醇的合成，降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平；并通過增加肝細胞表面的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）受體以增強LDL-C攝取和代謝。阿托伐他汀鈣可降低純合子型和雜合子型家族性高膽固醇血癥、非家族性高膽固醇血癥和混合型血脂異?；颊叩目偰懝檀迹═C），LDL-C和載脂蛋白B水平，為新一代他汀類降血脂藥。

現有國內外產品質量標準、各國藥典[1-3]及相關文獻報道[4-12]中有關物質檢測方法，存在分析時間過長、分離度較差等問題，均不能很好分離本文中涉及的15個雜質。經查閱文獻，參考各國藥典，采用靈敏度和分離度更高、分析速度更快的超高效液相色譜法（UPLC）測定阿托伐他汀鈣中的雜質。本論文所建立的檢測方法操作簡便，結果準確，分離度與重復性好，分析效率高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津Nexera X2 LC-30AD超高壓液相色譜儀，島津Nexera X2 SPD-M30A光電二極管陣列檢測器（日本島津公司）；Waters Empower 3軟件（美國沃特世公司）；XP6百萬分之一電子天平，XP205DR十萬分之一電子天平，FE20 pH計（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥

阿托伐他汀鈣原料藥（常州制藥廠有限公司，批號：EAT190401，EAT190402，EAT190403，EAT190404，EAT191101，EAT191102，EAT191103，EAT191104）；阿托伐他汀鈣，雜質A、B、C、D對照品（USP）；雜質M、O、P對照品（QCCUSA公司）；雜質L、N對照品（Trc公司）；雜質F、G、H、I、J、K（常州制藥廠有限公司合成制備，經紫外、紅外、質譜和核磁共振分析結構確證）；乙腈，甲醇，N,N-二甲基甲酰胺（DMF），四氫呋喃（無穩定劑）為色譜純；冰醋酸，醋酸銨為分析純；試驗用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津Shim-pack Velox PFPP（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A：3.9 g/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調節pH至5.0）:乙腈:甲醇:四氫呋喃（無穩定劑）=67:21:6:6，流動相B：3.9 g/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調pH至5.0）:乙腈:甲醇:四氫呋喃（無穩定劑）=27:61:6:6，按表1進行梯度洗脫，流速：0.43 ml/min；檢測波長：244 nm；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進樣量：1.8 μl；稀釋液：DMF。

表1 流動相洗脫梯度

2.2 溶液的制備

雜質定位溶液：依次稱取阿托伐他汀鈣對照品、雜質A（阿托伐他汀脫氟物）、雜質B （阿托伐他汀非對映異構體）、雜質C （阿托伐他汀雙氟物）、雜質D、雜質F（阿托伐他汀二聚物）、雜質G（阿托伐他汀甲酯）、雜質H（阿托伐他汀內酯）、 雜質I、雜質J（阿托伐他汀乙酯）、雜質K（阿托伐他汀叔丁酯）、雜質L、雜質M、雜質N、雜質O、雜質P對照品各5 mg，分別置入16個100 ml量瓶，加稀釋液溶解稀釋至刻度，搖勻。

系統適應性溶液：稱取阿托伐他汀鈣對照品和雜質A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P對照品各2.5 mg，置入同一50 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

標準曲線溶液：精密稱取阿托伐他汀鈣對照品和各雜質A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P對照品各5 mg，分別置入同一100 ml量瓶，加稀釋液溶解稀釋至刻度，搖勻，再精密移取5 ml至25 ml量瓶，加稀釋液至刻度，搖勻作為線性貯備液，再分別移取0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml線性貯備液，置入10 ml量瓶，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻（相對于樣品中雜質含量分別為0.03 %，0.05 %，0.10 %，0.15 %，0.20 %，0.25 %，0.30 %），作為線性溶液。

供試品溶液：稱取阿托伐他汀鈣樣品約50 mg，置入50 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

對照溶液：量取1 ml供試品溶液，置入100 ml量瓶，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻。再量取5 ml，置入50 ml量瓶，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻。

降解實驗溶液：稱取阿托伐他汀鈣樣品7份，每份50 mg，分別置入50 ml量瓶，分別進行酸破壞（加0.5 mol/L鹽酸溶液2 ml，放置24 h，加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml調pH至中性）、堿破壞（加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液4 ml，放置 24 h，加0.5 mol/L鹽酸溶液4 ml調pH至中性）、氧化破壞（加30 %雙氧水4 ml放置14 d）、光照破壞（置于4500±500 Lx下光照40 d）、高溫破壞（置于105 ℃放置40 d）、高濕破壞（置相對濕度92.5 %放置40 d）和未進行破壞。取上述樣品，分別加稀釋液溶解稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液；移取各破壞的供試品溶液1 ml，置入100 ml量瓶，加稀釋液定容，搖勻；再移取5 ml，置入50 ml量瓶，加稀釋液至刻度，搖勻，作為對照溶液；精密稱取阿托伐他汀鈣對照品25 mg，置入25 ml量瓶，加稀釋液溶解，定容，搖勻，再精密吸取10 ml，置入25 ml量瓶，加稀釋液溶解，定容，搖勻，作為含量對照品溶液（用于質量平衡）；精密吸取各破壞的供試品溶液10 ml，置入25 ml量瓶，加稀釋液稀釋至刻度，作為含量供試品溶液。

2.3 結果

2.3.1 專屬性試驗 取系統適應性溶液和各雜質定位溶液，照2.1項下色譜條件進樣分析，結果表明，本色譜條件下，阿托伐他汀鈣主峰及各雜質峰間均能達到良好的分離，分離度均在1.5以上（見圖1）。

AT：阿托伐他汀鈣；IMP：雜質圖1 系統適應性圖譜注：雜質D和雜質M均出二個色譜峰

2.3.2 線性關系考察 取標準曲線溶液，照2.1項下色譜條件進樣分析，由質量濃度（μg/ml）對峰面積做線性回歸方程并計算其校正因子，具體數據見表2。結果表明，阿托伐他汀鈣和各雜質均在0.3～3.0 μg/ml范圍內線性良好。

表2 線性數據

2.3.3 檢測限和定量限 精密移取各雜質定位溶液適量，用稀釋液逐級稀釋，照2.1項下色譜條件進樣分析，按信噪比S/N=10計算定量限，定量限溶液連續6針峰面積RSD均小于10 %，各雜質定量限濃度水平均小于0.03 %（相對于樣品中雜質含量）；按信噪比S/N=3計算檢測限,各雜質檢測限濃度水平均小于0.01 % （相對于樣品中雜質含量），結果見表3。

表3 檢測限和定量限

2.3.4 回收率試驗 精密稱取雜質A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P對照品各5 mg，分別置入同一100 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密移取10 ml，置入50 ml量瓶，加稀釋液至刻度，搖勻，作為回收率貯備液，精密稱取阿托伐他汀鈣樣品20 mg共12份，分別置入20 ml量瓶，再分別移取0.6，2.0，3.0，6.0 ml回收率貯備液置入20 ml量瓶，共3份，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻（相對于樣品中雜質含量分別為0.03 %，0.10 %，0.15 %，0.30 %），作為回收率供試品溶液。照2.1項下色譜條件測定上述12份溶液，計算每個雜質回收率和RSD，結果見表4，各雜質回收率均約100 %，且平行性較好。

表4 回收率試驗結果（n=12）

2.3.5 重復性試驗 稱取阿托伐他汀鈣樣品20 mg，共6份，分別置入20 ml量瓶，再分別移取2.3.4項下回收率貯備液3.0 ml，置入20 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻（相對于樣品中雜質含量為0.15 %）作為重復性試驗供試品溶液，照2.1項下色譜條件，連續測定6份重復性試驗供試品溶液，6份供試品溶液中各雜質含量RSD均小于5.0 %，結果表明，本方法本儀器重復性良好。

2.3.6 精密度試驗

2.3.6.1 進樣精密度試驗 照2.1項下色譜條件，連續測定對照溶液6次，按峰面積計算RSD為0.1 %，結果表明，本方法本儀器進樣精密度良好。

2.3.6.2 中間精密度試驗 不同天，由另一名檢驗員，使用另一臺UPLC儀器，按2.3.5項下方法配制6份中間精密度試驗溶液，照2.1項下色譜條件，連續測定6份溶液，計算6個溶液中各雜質含量RSD均小于5.0 %。同時計算兩名檢驗員間12份溶液各雜質含量RSD均小于5.0 %。結果表明，本方法中間精密度良好。

2.3.7 供試品溶液穩定性試驗 稱取阿托伐他汀鈣樣品約50 mg，置入50 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液，于儀器樣品室中（10 ℃），分別于0，4，8，12，18，24，32，40，48 h，照2.1項下色譜條件進樣分析，試驗結果表明，供試品溶液48 h內較穩定（與初始值0 h比較，無新增雜質，無雜質消失，各雜質增減在0.05 %之內）。

2.3.8 耐用性考察 根據2.1項下色譜條件，采用不同品牌PFPP UPLC色譜柱、柱溫（33，37 ℃）、流速（0.41，0.45 ml/min）、波長（242，246 nm）、流動相A中各組份比（66:22:6:6，68:20:6:6，67:21:5.8:6.2，67:21:6.2:5.8）和流動相B中各組份比（26:62:6:6，28:60:6:6，27:61:5.8:6.2，27:61:6.2:5.8），依次按2.1項下色譜條件進行系統適應性溶液試驗。結果表明，不同品牌PFPP UPLC色譜柱保留時間差異較大，如不使用推薦色譜柱，可能造成雜質A、L、B及主峰分離不夠；其他參數的微小變化下，各雜質峰間均能達到較好分離，基本不影響檢測。上述結果表明除對色譜柱要求較高外，本方法耐用性較好。

2.3.9 降解試驗結果 照2.1項下色譜條件依次進樣降解試驗溶液分析，結果見表5。在酸破壞、堿破壞、氧化破壞、高溫破壞、光照破壞、高濕破壞等條件下，可檢出除雜質A、雜質M、雜質G、雜質I除外的11個已知雜質，且阿托伐他汀鈣主峰及檢出各雜質峰的峰純度均符合要求（峰純度閾值大于峰純度角值），且質量保持平衡。表明此法專屬性好，能有效檢測樣品中的降解產物。

表5 降解試驗數據

2.3.10 樣品檢測結果 對8個批次阿托伐他汀鈣樣品進行檢測，結果見表6，第1～4批次樣品均未檢出文中研究的15個雜質，均檢出未知雜質，雜質總量均在0.1 %左右，第5～8批次樣品均檢出雜質L，且第6～7批次樣品均檢出已知雜質F，但上述雜質含量均較低，單個雜質含量均低于0.1 %，雜質總量均低于0.15 %。

表6 8個批次樣本檢測數據

3 討論

3.1 UPLC檢測方法建立的必要性

檢測上述15個已知雜質是各國藥典以及相關企業內控質量標準的內在要求。在酸破壞、堿破壞、氧化破壞、高溫破壞、光照破壞、高濕破壞等條件下，可檢出除雜質A、雜質M、雜質G、雜質K、雜質I的10個已知雜質，上述破壞試驗提示：在倉儲、運輸等過程中均有可能降解產生上述雜質，進而影響產品質量，因此建立簡單、便捷、可定量的方法對控制產品質量有重要的實際價值。相較于傳統HPLC方法，UPLC方法有分析時間更短、檢測靈敏度更高，進樣量更小等優勢，更適應生產企業高效率檢測等需要。

3.2 流動相選擇

流動相選擇參考了美國和歐洲藥典收載流動相體系，并結合本實驗室試驗結果進行優化選擇后最終確定。驗證過程中發現，甲醇和四氫呋喃的用量對有些雜質之間分離影響較大，且四氫呋喃對基線梯度影響較大，因此需準確量取甲醇和四氫呋喃。四氫呋喃應不添加穩定劑，如含穩定劑會影響主峰前后的基線，影響雜質A，L，B檢出能力及對照溶液主峰峰面積。同時要特別注意密封保存，防止水分及氧化物質進入使四氫呋喃變質，影響檢驗。

3.3 小結

本文以UPLC測定阿托伐他汀鈣原料藥中有關物質，結果表明，本法保留時間穩定，測定結果準確、精密度高、回收率符合檢測要求。與常規液相色譜法比較，分析時間大幅縮短，分離效率高，重復性好，溶劑用量少，環保經濟，可用于阿托伐他汀鈣原料藥的有關物質質量控制。