氮磷和鹽度對杜氏鹽藻生產(chǎn)性能的正交優(yōu)化試驗

郁彬琦 靳翠麗，2 劉 青，2 周曉見，2*

(1.揚州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州225127；2.揚州大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)研究所，江蘇揚州225127)

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）屬于綠藻門、綠藻綱、團藻目、鹽藻科、鹽藻屬，是一種沒有細胞壁的單細胞嗜鹽性真核藻類[1]。杜氏鹽藻光合自養(yǎng)，生長速度快，細胞物質(zhì)組成豐富；不僅含有豐富的油脂、β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、多糖、甘油，以及較高的Ca、P、Zn 等礦物質(zhì)，而且還含有包括必需氨基酸在內(nèi)的18 種氨基酸。杜氏鹽藻作為重要的水產(chǎn)開口餌料和常規(guī)生物餌料在魚、蝦、貝類育苗和養(yǎng)殖中得到了廣泛應(yīng)用，是重要的飼料添加劑，也是保健食品、精細化工、生物質(zhì)能源開發(fā)等眾多行業(yè)的重要原料生物[2-4]。

杜氏鹽藻的生物量產(chǎn)出及營養(yǎng)組成直接影響其培養(yǎng)的經(jīng)濟效益[5]。其中，杜氏鹽藻的生物量產(chǎn)出受多種生長條件影響，包括營養(yǎng)鹽、光照、溫度、鹽度、pH 值等[6-10]。而在不同培養(yǎng)條件下生長的細胞的物質(zhì)組成，如糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、色素的含量，也會有顯著差異。因此，通過優(yōu)化鹽藻的培養(yǎng)條件可能獲得更高生物量和更高品質(zhì)的目標(biāo)產(chǎn)品[5]。在杜氏鹽藻生長過程中，氮和磷是影響其生物量和物質(zhì)組成的主要營養(yǎng)鹽[11-12]。另外，由于杜氏鹽藻是嗜鹽性單胞藻，鹽度也是杜氏鹽藻至關(guān)重要的生長條件之一，會影響細胞的滲透壓和比重，進而影響生長和細胞物質(zhì)組成[13-14]。

所以，本文以杜氏鹽藻為對象，研究不同氮、磷的供給水平及不同鹽度對其生長及物質(zhì)產(chǎn)量的影響，通過正交試驗，探尋不同培養(yǎng)目標(biāo)的最佳培養(yǎng)條件，為杜氏鹽藻的規(guī)模化培養(yǎng)與開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

試驗藻種為杜氏鹽藻（D.salina，UTEX-LB-1644），由中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院藻種室提供。

1.2 培養(yǎng)條件和試驗設(shè)計

杜氏鹽藻采用一次性培養(yǎng)方式，250 mL 三角瓶中裝有150 mL 培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期藻種進行接種，接種后的初始密度為0.050×106個∕mL。三角瓶置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光暗比12 h∶12 h，光照強度4 000 Lux，溫度25 ℃，每天搖兩次。

預(yù)試驗：杜氏鹽藻的培養(yǎng)采用人工海水（鹽度30‰）配置的f∕2 培養(yǎng)基。其中氮源為NaNO3（終濃度為75 mg∕L），磷源為NaH2PO4·H2O（終濃度為5 mg∕L），氮和磷濃度在f∕2 配方標(biāo)準(zhǔn)濃度基礎(chǔ)上設(shè)置1∕8、1∕4、1∕2、1、3倍共5個濃度梯度，鹽度在20‰～90‰之間設(shè)置20‰、30‰、60‰、90‰共4 個梯度，以確定后期正交試驗測試的濃度或鹽度范圍，三個重復(fù)，培養(yǎng)12 d。

正交試驗：根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定氮的三個水平設(shè)置為NaNO3濃度分別為9.375、18.75、75.00 mg∕L，磷源三個水平設(shè)置為NaH2PO4·H2O 濃度分別為1.25、2.50、5.00 mg∕L，鹽度三個水平設(shè)置為20‰、30‰、60‰，形成三因素三水平的正交試驗。選擇L9（34）正交表安排試驗，試驗設(shè)置見表1，共有9 組試驗，每組試驗重復(fù)2 次，培養(yǎng)時間14 d。其中試驗9（75.00 mg∕L NaNO3，5.00 mg∕L NaH2PO4·H2O 和鹽度30‰）為正常f∕2培養(yǎng)條件，作為正交試驗優(yōu)化的對照。

表1 正交試驗方案

1.3 測定方法

1.3.1 杜氏鹽藻的生長情況測定

用血球計數(shù)板計數(shù)杜氏鹽藻細胞數(shù)量，再用酶標(biāo)儀測定相應(yīng)的OD660值，繪制吸光度與藻細胞密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每24 h 測定藻液的OD660值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的細胞密度，計算比生長速率，其公式為：

μ=(lnN-lnN0)∕T

式中：μ——比生長速率(d-1)；

N0——起始細胞密度（×106個∕mL）；

N——經(jīng)過T時間后的細胞密度（×106個∕mL）；

T——生長時間(d)。

1.3.2 杜氏鹽藻的物質(zhì)產(chǎn)量測定

培養(yǎng)14 d 后收獲杜氏鹽藻，測定藻粉干重、總脂含量、蛋白質(zhì)含量和總糖含量，計算各處理的物質(zhì)產(chǎn)量。

藻粉干重和總脂含量測定：取藻液110 mL 于4 000 r∕min離心10 min，沉淀用蒸餾水洗滌1次，轉(zhuǎn)移至小玻璃瓶中，放入-80 ℃冰箱中預(yù)凍，再于凍干機中凍干成藻粉后，放入真空干燥箱中干燥至恒重，得干藻粉，稱重記錄。采用氯仿∕甲醇抽提法測定杜氏鹽藻細胞內(nèi)總脂含量[15]：精確稱取10～50 mg干藻粉于離心管中，加入0.8 mL蒸餾水，使其充分混勻后，加入1 mL氯仿、2 mL甲醇，冰浴超聲波破碎（700 W，超聲5 s，間隔3 s）10 min，繼續(xù)加1 mL 氯仿充分振蕩混勻，再加1 mL 蒸餾水振蕩混勻，4 000 r∕min離心10 min，除去水層及藻細胞碎片層，保留氯仿層，蒸餾水洗滌兩次，吸取下層氯仿層于已經(jīng)烘干稱重好的試管中，常溫下蒸發(fā)溶劑后，放置50 ℃烘箱中烘30 min，稱重記錄。

蛋白質(zhì)和總糖含量測定：采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)含量[16]，苯酚-硫酸法測定總糖含量[17]。具體方法：取10 mL 藻液于4 000 r∕min 離心10 min，去上清，用去離子水定容至10 mL，搖勻。冰浴超聲破碎（700 W，超聲3 s，間隔3 s）10 min。再次離心，取上清液1 mL。加入5 mL 考馬斯亮藍染色液，搖勻靜置反應(yīng)5 min，在595 nm 處測定吸光度，根據(jù)用已知濃度的牛血清蛋白溶液測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量。另取上清液1 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液搖勻，用移液管迅速垂直滴入2.5 mL 濃硫酸，搖勻靜置反應(yīng)30 min，在490 nm下測定吸光度，根據(jù)用已知濃度葡萄糖溶液測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所獲得的數(shù)據(jù)利用IBM SPSS 22 軟件分析。正交試驗組別間差異選擇單因素ANOVA 方差分析，利用最小顯著差數(shù)法（LSD 法）進行多重比較。正交試驗方差分析選擇一般線性模型對氮、磷濃度和鹽度的效應(yīng)進行分析。各分析指標(biāo)差異顯著性以P=0.05 或0.01 作為標(biāo)準(zhǔn)[18]。繪圖采用Microsoft Excel軟件。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻培養(yǎng)的鹽度、氮和磷濃度預(yù)試驗結(jié)果

圖1 不同鹽度(a)和氮(b)、磷(c)濃度下杜氏鹽藻的生長情況

杜氏鹽藻在鹽度20‰～90‰之間都能生長[圖1(a)]。其中鹽度90‰時生長較差，培養(yǎng)12 d 后細胞密度遠低于其他鹽度。因此，將進一步優(yōu)化的鹽度范圍確定為20‰～60‰。杜氏鹽藻在氮源（NaNO3）濃度9.375 mg∕L 到75 mg∕L 之間都能正常生長[圖1(b)]，且繼續(xù)升高至225 mg∕L時相對于75 mg∕L未體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。9.375 mg∕L濃度下仍能表現(xiàn)為明顯的細胞密度增長。因此，將進一步優(yōu)化的氮源（NaNO3）濃度確定為9.375～75 mg∕L。杜氏鹽藻在磷源（NaH2PO4·H2O）濃度為0.625 mg∕L 到15 mg∕L 之間生長情況差異較大[圖1(c)]，0.625 mg∕L的低濃度磷源（NaH2PO4·H2O）濃度嚴(yán)重抑制杜氏鹽藻的生長，而15 mg∕L相對于5 mg∕L處理的優(yōu)勢也并不明顯。因此，將進一步優(yōu)化的磷源（NaH2PO4·H2O）濃度確定為1.25～5 mg∕L。

2.2 正交試驗不同組別杜氏鹽藻的生長情況

根據(jù)上述預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)計并進行了杜氏鹽藻在不同氮和磷濃度、鹽度組合的正交試驗。在不同的試驗條件下，培養(yǎng)14 d后的細胞密度范圍為0.489×106～0.806×106個∕mL 之間，比生長速率為0.162～0.198 d-1（表2）。對照組9細胞密度為0.670×106個∕mL，試驗組5、7均超過對照組，尤其試驗組5在正交試驗9個組中杜氏鹽藻生長最優(yōu)，最終細胞密度和比生長速率分別達到最低組（試驗組6）的1.6倍和1.2倍。

2.3 正交試驗不同組別杜氏鹽藻的物質(zhì)產(chǎn)量

從收獲的杜氏鹽藻藻粉干重結(jié)果來看[圖2(a)]，杜氏鹽藻在試驗組5的條件下得到的藻粉干重最大，顯著高于其他試驗組包括對照組，其次是試驗組7，而藻粉干重最低的是試驗組1，只有試驗組5 的1∕2。從蛋白質(zhì)產(chǎn)量看[圖2(b)]，試驗組7、8、9的蛋白質(zhì)含量顯著高于其他試驗組，最高值是試驗組8，產(chǎn)量是最低試驗組3 的2.3 倍。各試驗組的糖產(chǎn)量也有顯著差異[圖2(c)]，試驗組1、2、6和9組的糖產(chǎn)量最高，而試驗組5和7的糖產(chǎn)量最低，最高值試驗組1的糖產(chǎn)量是最低值試驗組5的3.2倍。各試驗組的脂肪產(chǎn)量也有顯著差異[圖2(d)]，試驗組5、6和7組的杜氏鹽藻細胞內(nèi)脂肪含量顯著高于其他組，其余試驗組包括對照組杜氏鹽藻的脂肪含量較低且無顯著差異，脂肪產(chǎn)量最高（第7組）可達22.783 mg∕L，是試驗組8的5.8倍。

表2 各試驗組杜氏鹽藻的生長情況

圖2 各試驗組杜氏鹽藻的物質(zhì)產(chǎn)量

2.4 正交試驗對杜氏鹽藻產(chǎn)量有顯著性影響的因素分析

對正交試驗所得的試驗結(jié)果進行直觀分析，發(fā)現(xiàn)試驗的三個因素對杜氏鹽藻收獲時得到的藻粉干重和蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響相似，由大到小依次均為：氮源（NaNO3）濃度＞鹽度＞磷源（NaH2PO4·H2O）濃度。而對總糖產(chǎn)量和脂肪產(chǎn)量的影響也相似，由大到小依次均為：鹽度＞氮源（NaNO3）濃度＞磷源（NaH2PO4·H2O）濃度。三個因素中，對杜氏鹽藻四類物質(zhì)產(chǎn)量的綜合影響最小的是磷源（NaH2PO4·H2O）。

對正交試驗的三個因素進行方差分析，結(jié)果見表3。三個因素中，氮源（NaNO3）濃度對藻粉干重、蛋白質(zhì)產(chǎn)量均有極顯著影響（P＜0.01）。鹽度對藻粉干重、總糖產(chǎn)量也都有極顯著影響（P＜0.01），且對蛋白質(zhì)產(chǎn)量有顯著性影響（P＜0.05）。而磷源（NaH2PO4·H2O）對所有產(chǎn)量影響都不顯著（P＞0.05）。

將有顯著性影響的因素對物質(zhì)產(chǎn)量作圖得到圖3。從圖3(a)可以發(fā)現(xiàn)，藻粉干重在氮源（NaNO3）濃度為18.75 mg∕L 時達到最大值，氮源（NaNO3）濃度為75 mg∕L 的藻粉干重高于9.38 mg∕L 時的藻粉干重。從圖3(b)可以發(fā)現(xiàn)，藻粉干重隨鹽度升高而升高，在60‰最高。從圖3(c)可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)產(chǎn)量隨氮源（NaNO3）濃度增大而增大，在75 mg∕L 時最高。從圖3(d)可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)產(chǎn)量隨鹽度升高而降低，鹽度20‰時蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高。從圖3(e)可以發(fā)現(xiàn)，總糖產(chǎn)量隨鹽度升高而降低，在鹽度20‰時總糖產(chǎn)量最高。由于各因素對總脂產(chǎn)量的影響、磷源（NaH2PO4·H2O）濃度對各物質(zhì)產(chǎn)量的影響、以及氮源（NaNO3）濃度對總糖產(chǎn)量的影響未達到顯著水平，未做分析。

綜合來看，氮和鹽度對杜氏鹽藻的產(chǎn)量影響顯著，以藻粉干重為目標(biāo)的生產(chǎn)，可以選用氮源（Na?NO3）濃度和鹽度為18.75 mg∕L 和60‰ 的組合，以蛋白質(zhì)產(chǎn)量為目標(biāo)的生產(chǎn)，可以選擇氮源（NaNO3）濃度75 mg∕L和鹽度20‰ 的組合，以總糖產(chǎn)量為目標(biāo)的生產(chǎn)則以鹽度20‰為最優(yōu)條件。

3 討論

杜氏鹽藻是優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)動物著色劑，能夠改善養(yǎng)殖動物的體色，還可以提高動物的生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率，并減少疾病[19-21]。因此，杜氏鹽藻藻粉的添加對于提高飼料質(zhì)量和飼養(yǎng)的動物產(chǎn)品質(zhì)量均具有重要意義。正交試驗結(jié)果表明，試驗組5 的培養(yǎng)條件對藻粉干重的獲取最為有利，其具體條件為NaNO318.75 mg∕L、NaH2PO4·H2O 2.50 mg∕L、鹽度為60‰，屬于中等濃度的氮磷供應(yīng)、高鹽度條件。當(dāng)培養(yǎng)目的為飼料添加藻粉時，該條件可顯著提高藻粉產(chǎn)量，從而提高培養(yǎng)的經(jīng)濟效益。

杜氏鹽藻作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的優(yōu)質(zhì)餌料，是優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白質(zhì)來源[22-23]。本正交試驗結(jié)果表明，隨著氮源濃度升高，蛋白質(zhì)產(chǎn)量持續(xù)上升。另外，低鹽也有利于蛋白質(zhì)生產(chǎn)。所以，當(dāng)培養(yǎng)目的對產(chǎn)出的藻粉蛋白質(zhì)含量要求較高時，杜氏鹽藻的培養(yǎng)應(yīng)在保證氮源供給充足的情況下，適當(dāng)降低培養(yǎng)體系的鹽度，可達到提升杜氏鹽藻細胞蛋白質(zhì)含量的目的。杜氏鹽藻多糖具有抗氧化、抑菌、消炎、增強肌體免疫等多種生物活性和功能，還能顯著降低貯藏后期對蝦的硬度[24-26]。本試驗研究的因素中，鹽度對總糖的產(chǎn)量有極顯著的影響，低鹽有利于杜氏鹽藻細胞的總糖的積累，高鹽度對總糖積累的抑制較為強烈[圖3(e)]。另外，考慮到低鹽也有利于蛋白質(zhì)的積累，所以，目標(biāo)為高總糖和蛋白質(zhì)含量的杜氏鹽藻培養(yǎng)，推薦低鹽培養(yǎng)條件。

圖3 氮源（NaNO3）濃度和鹽度對杜氏鹽藻物質(zhì)產(chǎn)量的影響

4 結(jié)論

綜上所述，鹽度和培養(yǎng)基的氮源濃度，對于提高杜氏鹽藻的物質(zhì)生產(chǎn)有顯著效果，磷源濃度對各物質(zhì)生產(chǎn)的影響不顯著。其中，氮源供應(yīng)充足有利于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，低鹽度（20‰）有利于蛋白質(zhì)和總糖的生產(chǎn)，中等濃度的氮源（NaNO318.75 mg∕L）和高鹽度（60‰）有利于藻粉干重的生產(chǎn)。根據(jù)杜氏鹽藻的不同培養(yǎng)目的，對鹽度和氮源濃度進行合理的組合，能夠使杜氏鹽藻的培養(yǎng)效益進一步提高。