復方腸泰抑制新生血管生成的實驗研究

劉靜冰 李靈常 魏國利 吳夏慧 李檢閱 霍介格

（南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院腫瘤科，江蘇南京210028）

腸癌是最常見的消化系統惡性腫瘤，據《2015年中國癌癥數據》報道，2015 年我國結直腸癌患者新增人數超過37 萬人，死亡超過19 萬人，發病率和死亡率在所有惡性腫瘤中居第五位[1]。中醫藥在結直腸癌的治療中發揮著日益重要的作用。復方腸泰系我院腫瘤科治療結腸癌的經驗方，由人參、薏苡仁、白花蛇舌草、莪術、八月札和藤梨根等六味中藥組成。人參中的人參皂苷Rg3 是重要的抗血管生成因子，可抑制肝癌、結腸癌等多種腫瘤的新生血管生成[2-3]。課題組前期研究發現，復方腸泰通過半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）誘導結腸癌細胞SW480 凋亡，誘導自噬體活化巨噬細胞而促進抗腫瘤免疫應答，誘導HT-29 移植瘤細胞自噬和凋亡，抑制裸鼠移植瘤生長[4-5]。因此，我們推測復方腸泰可能具有抗新生血管生成作用，并與其抗結腸癌作用相關，故本研究以人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和SCID小鼠為研究對象，探索復方腸泰對新生血管生成的影響。

1 實驗材料

1.1 細胞和實驗動物 HUVEC：產品編號H-007F-C，澳賽爾斯生物科技（上海有限公司）。雄性SCID小鼠：SPF級，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號為SCXK（滬）2017-0005。本研究動物倫理備案號：AEWC-20181020-55。

1.2 藥物與試劑 復方腸泰，處方：人參10 g，黃芪15 g，藤梨根15 g，薏苡仁20 g，苦參6 g，八月札10 g。加10倍體積水浸泡30 min后煮2 h，藥渣加8倍水再煮2 h，煎煮液100目篩網過濾，冷卻后2次濾液經蒸發儀濃縮至220 mL，作為飲片水煎液，生藥濃度2.50 g/mL。加磷酸緩沖鹽溶液（PBS）于離心半徑8 cm，10 000 r/min離心10 min后取上清液，根據不同濃度需要加入一定量的PBS稀釋，使用濾器過濾除菌，4 ℃冰箱保存備用。

內皮細胞培養基（ECM）：貨號1001，品牌ScienCell，產地美國，規格500 mL，北京索萊寶科技有限公司。無血清培養基（SFM）：貨號17705-021，品牌Gibco，規格500 mL，南京信帆生物技術有限公司。CCK-8試劑盒：目錄號M4839，品牌AbMole，規格5 mL，奧默生物科技（上海）有限公司。

1.3 主要實驗儀器 滾筒式細胞培養裝置，cell240，德國熱電；臺式高速離心機，TGL-16G，中國；臺式低溫冷凍離心機，5417R，德國Eppendorf；CO2培養箱，Heracell150，德國；生物安全柜，classⅡ，美國Labconco；熒光倒置顯微鏡，CKX41-F32FL，日本奧林巴斯；全波長酶標儀，Molecular Devices SpectraMax M5，美國。

2 實驗方法

2.1 HUVEC細胞培養 HUVEC細胞置于ECM中培養，添加1%血管內皮細胞生長補充物、5%胎牛血清（FBS）及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置37 ℃、5%CO2飽和濕度的溫箱中培養。

2.2 HUVEC劃痕試驗 HUVEC培養至90%融合，換至0.2%牛血清白蛋白（BSA）的SFM培養基中饑餓4 h，槍頭在每孔中畫線并加入生理鹽水（對照組）和不同濃度的復方腸泰（10、20、40 mg/mL）培養0.5 h，每組設3個復孔；將每孔培養基換為10% FBS和相應濃度復方腸泰繼續培養24 h；每孔置于倒置顯微鏡（×100）下拍照，采用圖像分析軟件Image-Pro Plus分析每孔細胞發生遷移前后照片，計算損傷后細胞遷移到損傷部位的細胞數。試驗重復3次。

2.3 HUVEC CCK-8試驗 HUVEC以3.5×103/孔接種于96孔板中過夜，饑餓4 h后用生理鹽水（對照組）和不同濃度的復方腸泰（10、20、40 mg/mL）培養1 h，每個濃度設3個復孔。將培養基換成含相應濃度的復方腸泰和2% FBS的SFM，分別繼續培養12、24或48 h后，加入CCK-8孵育4 h。酶標儀檢測各孔450 nm處吸光值（A），增殖抑制率=（A陰性對照-A樣品）/（A陰性對照-A空白對照）×100%。試驗重復3次。

2.4 HUVEC小管形成試驗 HUVEC加入鋪好Matrigel的96孔培養板中，加入生理鹽水（對照組）和不同濃度的復方腸泰（10、20、40 mg/mL），每個濃度設5個復孔，放入37 ℃培養箱中孵育24 h。將每孔置于倒置顯微鏡（×100）下拍照，圖像分析各孔形成小管的數量。試驗重復3次。

2.5 SCID小鼠Matrigel栓試驗 將20只6周齡雄性SCID小鼠隨機分為4組，每組5只。每只小鼠背部左側皮下注射GFR-Matrigel混合物400 μL，背部右側皮下注射Matrigel混合物400 μL。第2日開始每組小鼠予生理鹽水（模型組）和不同濃度的復方腸泰（13.90、27.80、55.60 g/kg）灌胃，每日1次，每次0.2 mL。連續灌胃7 d后處死小鼠，取出背部Matrigel栓。各組膠栓在離心管中剪碎，加入RIPA裂解液500 μL，離心后取上清200 μL/樣本，移入96孔酶標板中，酶標儀415 nm波長讀取血紅蛋白A值。

2.6 統計學方法 使用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，數據以（）表示。多組間比較采用ANOVA分析，2 組間比較采用t檢驗，P＜0.05為具有顯著性差異。

3 實驗結果

3.1 復方腸泰對HUVEC遷移能力的影響 在劃痕試驗中，復方腸泰組HUVEC細胞劃痕間傷口愈合距離百分比低于對照組，說明復方腸泰能抑制HUVEC向損傷部位遷移（圖1）。遷移量化分析顯示（圖2），與對照組比較復方腸泰各劑量均能明顯抑制HUVEC遷 移（P＜0.05），復 方 腸 泰10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL組的遷移抑制率分別為23.46%、45.64%和67.52%，40 mg/mL組抑制率顯著高于10 mg/mL和20 mg/mL組（P＜0.05），其抑制作用具有濃度依賴性。

3.2 復方腸泰對HUVEC增殖的影響 CCK-8檢測結果表明：同一作用時間下，隨復方腸泰濃度增加，細胞增殖抑制率升高；而在同一作用濃度下，隨作用時間延長，增殖抑制率升高。說明復方腸泰能抑制HUVEC增殖，且具有濃度和時間依賴性。見圖3。

3.3 復方腸泰對HUVEC小管形成的影響 復方腸泰能夠抑制HUVEC在Matrigel上形成網狀小管結構。10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL復方腸泰的小管抑制率分別為38.89%、72.22%和88.89%（P＜0.05），說明復方腸泰能抑制HUVEC小管形成并有濃度依賴性，見圖4。

3.4 復方腸泰對SCID小鼠皮下移植matrigel栓中血紅蛋白含量的影響 Matrigel栓試驗結果顯示，小鼠予13.90、27.80、55.60 g/kg復方腸泰灌胃后，皮下移植的matrigel栓中血紅蛋白含量分別為（0.81±0.04）μg/mg、（0.47±0.02）μg/mg和（0.28±0.01）μg/mg，明 顯低于對照組（P＜0.05）；且復方腸泰55.60 g/kg組matrigel栓中血紅蛋白含量亦明顯低于復方腸泰13.90 g/kg和27.80 g/kg組（P＜0.05）。說明復方腸泰對SCID小鼠體內的血管新生有明顯的抑制作用，該作用有濃度依賴性。見圖5。

圖1 各組HUVEC遷移能力比較（×100）

圖2 各組HUVEC遷移抑制率比較

圖3 各組HUVEC增殖抑制率比較

圖4 復方腸泰對HUVEC小管形成的影響（×100）

圖5 各組Matrigel栓中血紅蛋白含量比較

4 討論

腸癌可歸屬于中醫學“癥瘕”“積聚”“腸覃”“鎖肛痔”等范疇。李東垣《脾胃論》云：“脾胃元氣既傷，元氣亦不能充，而諸病之所由生也。”明代《外科正宗》載：“蘊毒結于臟腑，火熱流注肛門，結而為腫，其患痛連小腹，肛門墜重，二便乖違，或瀉或秘，肛門內蝕，串爛經絡，污水流通大孔……凡犯此未得見其有生。”腸癌病機總屬本虛標實，本課題組將其總結為“脾虛是結直腸癌發病的基礎，濕熱瘀毒互結是發病的關鍵”[6]，治療當以益氣健脾、清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛為主。復方腸泰方中人參益氣健脾、扶正固本，薏苡仁健脾化濕，白花蛇舌草清熱解毒，莪術活血化瘀、消腫散結，八月札和藤梨根行氣活血、消積止痛。在臨床應用中，復方腸泰聯合化療能顯著改善腸癌患者臨床癥狀和生活質量，提高CD3+和CD4+淋巴細胞計數，提高結腸癌患者體力狀況和免疫狀態，起到減毒增效作用[7]。

20世紀70年代，哈佛大學的Folkman教授首次提出“腫瘤血管生成”的概念，認為腫瘤新生血管為腫瘤生長提供營養，迂曲的血管造成局部缺氧微環境甚至誘導耐藥，脫落的癌細胞通過循環運送至全身導致轉移[8]。血管新生是一個多步驟的過程，血管內皮細胞首先遷移到靶部位，黏附到組織后細胞開始增殖，增殖后的內皮細胞會形成網狀的小管樣結構。HUVEC是用膠原酶消化臍帶靜脈所得的血管內皮細胞，具有高活性、高純度、可在體外培養的優點[9]，常常作為抗血管生成研究的良好研究對象。本研究我們通過劃痕試驗、CCK-8和小管形成試驗，發現復方腸泰可以顯著抑制HUVEC的遷移、增殖和小管形成。Matrigel是一種可溶的腫瘤基底膜提取物，含有豐富的促血管新生物質，在室溫下凝固重新構成基底膜。因而將Matrigel注射到小鼠皮下形成Matrigel栓模擬腫瘤基質誘導新生血管生成，而通過檢測Matrigel栓中的血紅蛋白量可反映含有血流的血管數，從而間接反映新生血管生成的能力。本研究將Matrigel注射到SCID小鼠皮下形成Matrigel栓，小鼠予復方腸泰灌胃后可以看到Matrigel栓中血紅蛋白量明顯低于模型組，從而證明復方腸泰在體內可以抑制新生血管生成。

既往大量研究表明，中醫藥具有抗血管生成作用。薏苡仁注射液、人參皂苷Rg3以及某些中藥復方能降低腫瘤微血管密度，下調血管內皮生長因子（VEGF）等促腫瘤血管生成因子的表達，對腫瘤血管生成具有抑制作用[10-12]。人參中的人參皂苷Rg3通過降低腫瘤細胞分泌的VEGF來抑制腫瘤新生血管生成[13]，通過減少腫瘤細胞分泌金屬基質蛋白酶-9（MMP-9）來抑制血管內皮細胞的增殖和遷移[14]。本研究結果表明，復方腸泰具有抗新生血管生成作用，為進一步開展Ⅲ期臨床研究和擴大臨床應用增加了基礎研究的支撐，另外也說明中藥復方的抗腫瘤作用不像西藥那樣單一，具有泛靶點、多機制的特點，因而不容易出現耐藥。

綜上所述，復方腸泰在細胞水平能抑制HUVEC與新生血管生成相關的多步驟的生物學行為，包括HUVEC的遷移、增殖和小管形成，在動物水平能顯著抑制SCID小鼠體內的血管新生，據此推斷復方腸泰能抑制新生血管生成。課題組后續將以荷結腸癌小鼠為研究對象，進一步研究復方腸泰對小鼠結腸癌新生血管的影響，及其涉及的信號通路和抗血管生成的具體機制。