復(fù)方腸泰抑制新生血管生成的實(shí)驗(yàn)研究

劉靜冰 李靈常 魏國(guó)利 吳夏慧 李檢閱 霍介格

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京210028）

腸癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)《2015年中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)》報(bào)道，2015 年我國(guó)結(jié)直腸癌患者新增人數(shù)超過(guò)37 萬(wàn)人，死亡超過(guò)19 萬(wàn)人，發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中居第五位[1]。中醫(yī)藥在結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮著日益重要的作用。復(fù)方腸泰系我院腫瘤科治療結(jié)腸癌的經(jīng)驗(yàn)方，由人參、薏苡仁、白花蛇舌草、莪術(shù)、八月札和藤梨根等六味中藥組成。人參中的人參皂苷Rg3 是重要的抗血管生成因子，可抑制肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的新生血管生成[2-3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方腸泰通過(guò)半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 凋亡，誘導(dǎo)自噬體活化巨噬細(xì)胞而促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)HT-29 移植瘤細(xì)胞自噬和凋亡，抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)[4-5]。因此，我們推測(cè)復(fù)方腸泰可能具有抗新生血管生成作用，并與其抗結(jié)腸癌作用相關(guān)，故本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和SCID小鼠為研究對(duì)象，探索復(fù)方腸泰對(duì)新生血管生成的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 HUVEC：產(chǎn)品編號(hào)H-007F-C，澳賽爾斯生物科技（上海有限公司）。雄性SCID小鼠：SPF級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。本研究動(dòng)物倫理備案號(hào)：AEWC-20181020-55。

1.2 藥物與試劑 復(fù)方腸泰，處方：人參10 g，黃芪15 g，藤梨根15 g，薏苡仁20 g，苦參6 g，八月札10 g。加10倍體積水浸泡30 min后煮2 h，藥渣加8倍水再煮2 h，煎煮液100目篩網(wǎng)過(guò)濾，冷卻后2次濾液經(jīng)蒸發(fā)儀濃縮至220 mL，作為飲片水煎液，生藥濃度2.50 g/mL。加磷酸緩沖鹽溶液（PBS）于離心半徑8 cm，10 000 r/min離心10 min后取上清液，根據(jù)不同濃度需要加入一定量的PBS稀釋，使用濾器過(guò)濾除菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM）：貨號(hào)1001，品牌ScienCell，產(chǎn)地美國(guó)，規(guī)格500 mL，北京索萊寶科技有限公司。無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）：貨號(hào)17705-021，品牌Gibco，規(guī)格500 mL，南京信帆生物技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒：目錄號(hào)M4839，品牌AbMole，規(guī)格5 mL，奧默生物科技（上海）有限公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 滾筒式細(xì)胞培養(yǎng)裝置，cell240，德國(guó)熱電；臺(tái)式高速離心機(jī)，TGL-16G，中國(guó)；臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)，5417R，德國(guó)Eppendorf；CO2培養(yǎng)箱，Heracell150，德國(guó)；生物安全柜，classⅡ，美國(guó)Labconco；熒光倒置顯微鏡，CKX41-F32FL，日本奧林巴斯；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Molecular Devices SpectraMax M5，美國(guó)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞置于ECM中培養(yǎng)，添加1%血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物、5%胎牛血清（FBS）及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置37 ℃、5%CO2飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。

2.2 HUVEC劃痕試驗(yàn) HUVEC培養(yǎng)至90%融合，換至0.2%牛血清白蛋白（BSA）的SFM培養(yǎng)基中饑餓4 h，槍頭在每孔中畫(huà)線并加入生理鹽水（對(duì)照組）和不同濃度的復(fù)方腸泰（10、20、40 mg/mL）培養(yǎng)0.5 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；將每孔培養(yǎng)基換為10% FBS和相應(yīng)濃度復(fù)方腸泰繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔置于倒置顯微鏡（×100）下拍照，采用圖像分析軟件Image-Pro Plus分析每孔細(xì)胞發(fā)生遷移前后照片，計(jì)算損傷后細(xì)胞遷移到損傷部位的細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 HUVEC CCK-8試驗(yàn) HUVEC以3.5×103/孔接種于96孔板中過(guò)夜，饑餓4 h后用生理鹽水（對(duì)照組）和不同濃度的復(fù)方腸泰（10、20、40 mg/mL）培養(yǎng)1 h，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)基換成含相應(yīng)濃度的復(fù)方腸泰和2% FBS的SFM，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24或48 h后，加入CCK-8孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處吸光值（A），增殖抑制率=（A陰性對(duì)照-A樣品）/（A陰性對(duì)照-A空白對(duì)照）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 HUVEC小管形成試驗(yàn) HUVEC加入鋪好Matrigel的96孔培養(yǎng)板中，加入生理鹽水（對(duì)照組）和不同濃度的復(fù)方腸泰（10、20、40 mg/mL），每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。將每孔置于倒置顯微鏡（×100）下拍照，圖像分析各孔形成小管的數(shù)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 SCID小鼠Matrigel栓試驗(yàn) 將20只6周齡雄性SCID小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。每只小鼠背部左側(cè)皮下注射GFR-Matrigel混合物400 μL，背部右側(cè)皮下注射Matrigel混合物400 μL。第2日開(kāi)始每組小鼠予生理鹽水（模型組）和不同濃度的復(fù)方腸泰（13.90、27.80、55.60 g/kg）灌胃，每日1次，每次0.2 mL。連續(xù)灌胃7 d后處死小鼠，取出背部Matrigel栓。各組膠栓在離心管中剪碎，加入RIPA裂解液500 μL，離心后取上清200 μL/樣本，移入96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀415 nm波長(zhǎng)讀取血紅蛋白A值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用ANOVA分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 復(fù)方腸泰對(duì)HUVEC遷移能力的影響 在劃痕試驗(yàn)中，復(fù)方腸泰組HUVEC細(xì)胞劃痕間傷口愈合距離百分比低于對(duì)照組，說(shuō)明復(fù)方腸泰能抑制HUVEC向損傷部位遷移（圖1）。遷移量化分析顯示（圖2），與對(duì)照組比較復(fù)方腸泰各劑量均能明顯抑制HUVEC遷 移（P＜0.05），復(fù) 方 腸 泰10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL組的遷移抑制率分別為23.46%、45.64%和67.52%，40 mg/mL組抑制率顯著高于10 mg/mL和20 mg/mL組（P＜0.05），其抑制作用具有濃度依賴性。

3.2 復(fù)方腸泰對(duì)HUVEC增殖的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明：同一作用時(shí)間下，隨復(fù)方腸泰濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率升高；而在同一作用濃度下，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，增殖抑制率升高。說(shuō)明復(fù)方腸泰能抑制HUVEC增殖，且具有濃度和時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖3。

3.3 復(fù)方腸泰對(duì)HUVEC小管形成的影響 復(fù)方腸泰能夠抑制HUVEC在Matrigel上形成網(wǎng)狀小管結(jié)構(gòu)。10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL復(fù)方腸泰的小管抑制率分別為38.89%、72.22%和88.89%（P＜0.05），說(shuō)明復(fù)方腸泰能抑制HUVEC小管形成并有濃度依賴性，見(jiàn)圖4。

3.4 復(fù)方腸泰對(duì)SCID小鼠皮下移植matrigel栓中血紅蛋白含量的影響 Matrigel栓試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠予13.90、27.80、55.60 g/kg復(fù)方腸泰灌胃后，皮下移植的matrigel栓中血紅蛋白含量分別為（0.81±0.04）μg/mg、（0.47±0.02）μg/mg和（0.28±0.01）μg/mg，明 顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；且復(fù)方腸泰55.60 g/kg組matrigel栓中血紅蛋白含量亦明顯低于復(fù)方腸泰13.90 g/kg和27.80 g/kg組（P＜0.05）。說(shuō)明復(fù)方腸泰對(duì)SCID小鼠體內(nèi)的血管新生有明顯的抑制作用，該作用有濃度依賴性。見(jiàn)圖5。

圖1 各組HUVEC遷移能力比較（×100）

圖2 各組HUVEC遷移抑制率比較

圖3 各組HUVEC增殖抑制率比較

圖4 復(fù)方腸泰對(duì)HUVEC小管形成的影響（×100）

圖5 各組Matrigel栓中血紅蛋白含量比較

4 討論

腸癌可歸屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“積聚”“腸覃”“鎖肛痔”等范疇。李東垣《脾胃論》云：“脾胃元?dú)饧葌獨(dú)庖嗖荒艹洌T病之所由生也。”明代《外科正宗》載：“蘊(yùn)毒結(jié)于臟腑，火熱流注肛門，結(jié)而為腫，其患痛連小腹，肛門墜重，二便乖違，或?yàn)a或秘，肛門內(nèi)蝕，串爛經(jīng)絡(luò)，污水流通大孔……凡犯此未得見(jiàn)其有生。”腸癌病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，本課題組將其總結(jié)為“脾虛是結(jié)直腸癌發(fā)病的基礎(chǔ)，濕熱瘀毒互結(jié)是發(fā)病的關(guān)鍵”[6]，治療當(dāng)以益氣健脾、清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛為主。復(fù)方腸泰方中人參益氣健脾、扶正固本，薏苡仁健脾化濕，白花蛇舌草清熱解毒，莪術(shù)活血化瘀、消腫散結(jié)，八月札和藤梨根行氣活血、消積止痛。在臨床應(yīng)用中，復(fù)方腸泰聯(lián)合化療能顯著改善腸癌患者臨床癥狀和生活質(zhì)量，提高CD3+和CD4+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，提高結(jié)腸癌患者體力狀況和免疫狀態(tài)，起到減毒增效作用[7]。

20世紀(jì)70年代，哈佛大學(xué)的Folkman教授首次提出“腫瘤血管生成”的概念，認(rèn)為腫瘤新生血管為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，迂曲的血管造成局部缺氧微環(huán)境甚至誘導(dǎo)耐藥，脫落的癌細(xì)胞通過(guò)循環(huán)運(yùn)送至全身導(dǎo)致轉(zhuǎn)移[8]。血管新生是一個(gè)多步驟的過(guò)程，血管內(nèi)皮細(xì)胞首先遷移到靶部位，黏附到組織后細(xì)胞開(kāi)始增殖，增殖后的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)形成網(wǎng)狀的小管樣結(jié)構(gòu)。HUVEC是用膠原酶消化臍帶靜脈所得的血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有高活性、高純度、可在體外培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)[9]，常常作為抗血管生成研究的良好研究對(duì)象。本研究我們通過(guò)劃痕試驗(yàn)、CCK-8和小管形成試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)復(fù)方腸泰可以顯著抑制HUVEC的遷移、增殖和小管形成。Matrigel是一種可溶的腫瘤基底膜提取物，含有豐富的促血管新生物質(zhì)，在室溫下凝固重新構(gòu)成基底膜。因而將Matrigel注射到小鼠皮下形成Matrigel栓模擬腫瘤基質(zhì)誘導(dǎo)新生血管生成，而通過(guò)檢測(cè)Matrigel栓中的血紅蛋白量可反映含有血流的血管數(shù)，從而間接反映新生血管生成的能力。本研究將Matrigel注射到SCID小鼠皮下形成Matrigel栓，小鼠予復(fù)方腸泰灌胃后可以看到Matrigel栓中血紅蛋白量明顯低于模型組，從而證明復(fù)方腸泰在體內(nèi)可以抑制新生血管生成。

既往大量研究表明，中醫(yī)藥具有抗血管生成作用。薏苡仁注射液、人參皂苷Rg3以及某些中藥復(fù)方能降低腫瘤微血管密度，下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促腫瘤血管生成因子的表達(dá)，對(duì)腫瘤血管生成具有抑制作用[10-12]。人參中的人參皂苷Rg3通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF來(lái)抑制腫瘤新生血管生成[13]，通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞分泌金屬基質(zhì)蛋白酶-9（MMP-9）來(lái)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[14]。本研究結(jié)果表明，復(fù)方腸泰具有抗新生血管生成作用，為進(jìn)一步開(kāi)展Ⅲ期臨床研究和擴(kuò)大臨床應(yīng)用增加了基礎(chǔ)研究的支撐，另外也說(shuō)明中藥復(fù)方的抗腫瘤作用不像西藥那樣單一，具有泛靶點(diǎn)、多機(jī)制的特點(diǎn)，因而不容易出現(xiàn)耐藥。

綜上所述，復(fù)方腸泰在細(xì)胞水平能抑制HUVEC與新生血管生成相關(guān)的多步驟的生物學(xué)行為，包括HUVEC的遷移、增殖和小管形成，在動(dòng)物水平能顯著抑制SCID小鼠體內(nèi)的血管新生，據(jù)此推斷復(fù)方腸泰能抑制新生血管生成。課題組后續(xù)將以荷結(jié)腸癌小鼠為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究復(fù)方腸泰對(duì)小鼠結(jié)腸癌新生血管的影響，及其涉及的信號(hào)通路和抗血管生成的具體機(jī)制。