雙液相萃取棉仁粉工藝中甲醇相棉子糖s的精制

顧 恒 朱慶莉 云 志 蘭宏兵

(金陵科技學院1，南京 211169)(南京工業大學2，南京 211816)(鄭州輕工業大學3，鄭州 450001)

棉子糖(Raffinose)是由半乳糖、果糖和葡萄糖結合而成的一種三糖，也被稱為蜜三糖、蜜里三糖。它是一種植物體內普通存在的功能性低聚糖，具有很好的雙歧桿菌增殖作用和良好的整腸功效[1]，還能促進人體對鈣的吸收，阻止癌細胞生長，延長器官等的保存時間，故廣泛地應用于食品、醫療、化妝品等行業[2-4]。

棉花是我國主要的經濟作物之一，棉籽是棉花主要副產品，因此從棉籽中提取棉子糖，不僅獲得高價值產品，還提高資源的綜合利用率[5]。近幾十年來，眾多科研者圍繞如何從棉籽中提取棉子糖開展許多工作，如采用酶解提取結合離子交換樹脂法[6]，光波提取、陶瓷膜過濾，結合離子吸附法[7]提純棉子糖。崔勝成等[8]采用乙醇提取棉子糖，濃縮提取液，淡鹽水洗滌，結晶過濾得到棉子糖。趙永強等[9]公開一種經乙醇浸泡，過濾，加入晶種，再加入3～5倍乙醇，羥基型陰離子除雜，醋酸乙醇洗脫，濃縮等步驟從棉籽粕中獲得高純度棉子糖的方法。曹通等[10]公開一種以脫脂棉粕為原料，通過低濃度弱堿性有機溶劑萃取棉酚，從脫酚液中提取棉子糖，但未公開具體的提取過程與產率。

本課題組采用甲醇和石油醚按一定比例(3∶1)混合組成的雙液相溶劑(TPS)浸取處理棉仁粉[11-13]。通過該操作過程，棉仁粉中棉籽油、甾醇、維生素E等脂溶性物質進入到上層石油醚相；而棉子糖、棉酚、色素等則進入下層甲醇相。該過程通過一步萃取，實現了不同極性物質的分離。同時兩相溶劑相互洗脫，使得各自萃取得到的物質相對較純，提高萃取效率。經分離得到的下層溶液甲醇相中富含棉子糖，但同時也含有棉酚、色素、蛋白質等多種物質，這些雜質嚴重影響棉子糖的色澤及純度，因此欲得到高純度的棉子糖，還需要進一步精制[14]。課題組雖采取了一系列提高棉子糖純度的措施[15，16]，但未能兼顧純度與產率，也缺乏整體連貫性，未見從原料(雙液相溶劑萃取棉仁粉工藝中甲醇相)直接到達產品(高純度棉子糖)的整體操作路線。

本實驗以雙液相溶液萃取棉仁粉中的甲醇相為原料，依次通過脫色、脫蛋白及重結晶操作，擬獲得高純度、高產率的棉子糖產品，欲拓展雙液相溶劑(TPS)處理棉籽的工藝路線，進一步提升這一工藝的實用價值。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

棉仁粉，江蘇連云港棉籽，經電動粉碎后去棉粕得棉仁粉；甲醇相溶液，自制[7]，雙液相溶劑萃取棉仁粉后，固液分離，溶液靜置分層，分離后下層溶液即為甲醇相；硅藻土、粉末活性炭、棉子糖標品；無水乙醇、丙酮、乙醇、三氯乙酸均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜，外壓式中空纖維超濾器(表1)，RE-5299旋轉蒸發器。

表1 膜組件技術指標及規格

1.3 預處理

甲醇相中含有棉酚和棉子糖。棉酚不溶于水，在低濃度的甲醇溶液中也幾乎不溶，而棉子糖在水中溶解度大，因此利用棉酚與棉子糖在低濃度甲醇溶液中溶解度不同將棉酚除去。具體操作步驟為：向甲醇相中加入甲醇相體積30%的蒸餾水，再減壓蒸餾蒸出甲醇，大部分的棉酚在水相中析出，抽濾去除后，收集得到含糖水相，其組成成分見表2。

表2 含糖水相主要成分

1.4 棉子糖純化工藝

1.4.1 硅藻土與活性炭混合物處理棉子糖粗品

將含糖水相溶解于無水乙醇中，含糖水相與無水乙醇體積比1∶10，充分振蕩混合液使其均勻。將溶液置于離心管中，在5 000 r/min的轉速下離心15 min。將上層清液去除，下層移至燒杯中，放入真空干燥箱中干燥除去溶劑。取干燥后的2 g粗品溶解于25 mL的蒸餾水中，加入硅藻土與活性炭的混合物(混合物中兩者的比例為1∶1)，超聲波輔助機械攪拌15 min，真空抽濾，并用100 mL的蒸餾水分次洗滌，收集合并濾液，50 ℃真空干燥。

1.4.2 棉子糖溶液超濾除蛋白質

脫色處理后的棉子糖粗品中仍含有水溶性蛋白質等雜質。為了避免蛋白溶液的起泡影響后續的濃縮過程及得到高純度產品。實驗采用膜超濾分離技術處理棉子糖粗品中蛋白。超濾實驗裝置見圖1所示。

取10 g棉子糖粗品配制成1.5 L棉子糖溶液，將其放入料液貯槽1，啟動料液泵2，由閥門3和6控制超濾膜內料液流量，壓力表4和5顯示膜的進口壓力和出口壓力。料液由泵入超濾系統后，采用全循環模式，即滲透液循環回至原料液貯槽，透過液收集于滲透壓儲存槽。

注：1 料液貯槽；2 料液泵；3 進口調節閥；4 進口壓力表；5 出口壓力表；6 出口調節閥；7 濃縮液；8 原料液；9 滲透液；10 滲透液貯槽；11 控溫水浴。圖1 超濾實驗裝置圖

式(1)計算超濾壓力，式(2)計算超濾膜通量，膜通量通常用單位時間內通過單位膜面積的透過液的體積來表示[17]。質量分數30%的三氯乙酸(TCA)溶液用于檢測超濾透過液是否含有蛋白物質[18]。

(1)

式中：P為膜操作壓力/MPa；Pin為超濾膜進口處的壓力/MPa；Pout為超濾膜出口處的壓力/MPa。

(2)

式中：J為超濾通量/L·m-2·h-1；V為取樣體積/L；t為取樣時間/h；A為膜面積/m2。

1.4.3 棉子糖的重結晶

經脫色、超濾處理后的棉子糖溶液真空干燥，所得棉子糖樣品仍還有雜質，需進一步精制。具體步驟如下：取一定量棉子糖粗品，在超聲加熱下，溶解于重結晶溶劑(丙酮-乙醇-水，體積比2∶1∶0.5)中，直至粗品溶解。趁熱過濾，濾液室溫下超聲輔助冷卻結晶。濾液再置冰箱中冷凍結晶，一段時間后，振蕩抽濾得到晶體，晶體分別經石油醚、乙醇洗滌兩次。晶體真空干燥，稱重，計算其收率及純度。

1.5 分析方法

1.5.1 色值分析

色值表示糖品顏色深淺的數值，是評價糖品質量的重要指標。實驗用國際糖分析統一方法委員會(ICUMSA)規定的糖色值分析方法進行測定[19]。

(3)

式中：IU560為560 nm處國際糖溶液色值；A560為560 nm處測得的樣液吸光度；

b為比色皿厚度，1 cm；c為樣液干物質質量濃度/mg/mL。

1.5.2 棉子糖的檢測，及脫色率及收率計算

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測棉子糖的含量，具體檢測方法參照文獻[14]。

圍繞“實踐”概念所產生的爭論如此之多，并不是中國獨有的現象。再回到布爾迪厄所在的法國，對他的批評同樣猛烈而曠日持久。

(4)

(5)

式中：V1、V2分別為脫色前后溶液的體積/mL；C1、C2分別為脫色前后溶液中棉子糖的質量濃度/mg/mL。

(6)

2 結果與討論

2.1 硅藻土與活性炭混合物處理棉子糖粗品

2.1.1 脫色溫度的確定

溫度升高有利于降低溶液黏度，增強分子的擴散運動。圖2a映了隨著溫度的升高，脫色效果幾乎呈線性提高，但與此同時棉子糖收率逐漸降低，當溫度高于50 ℃后，可能發現一些副反應，收率急劇下降。因此選擇50 ℃作為適宜的脫色溫度。

2.1.2 脫色時間的確定

混合物與棉子糖溶液有一定的接觸時間是提高脫色率的必要條件。從圖2b可以看出，隨著脫色時間的延長，脫色率不斷提高，當脫色時間延長至2.5 h后，脫色率沒有明顯增加趨勢；但隨著時間的延長，收率不斷下降，而且下降的速率越來越明顯，因此從經濟，脫色率及收率等方面考慮，確定脫色時間為2 h。

2.1.3 硅藻土與活性炭混合物用量的確定

硅藻土和活性炭作為脫色劑最佳的脫色條件：混合物用量為3%，在50 ℃下脫色2 h。在此條件下，棉子糖的收率為85.6%，脫色率為89.1%。

2.2 棉子糖溶液超濾脫蛋白

2.2.1 超濾時間對膜通量的影響

取棉子糖溶液，測定pH為6，總蛋白質濃度為3.2%，在40 ℃下進行實驗，膜通量隨時間的變化如圖3所示。隨著超濾時間的延長，膜通量逐漸減小。開始膜通量下降得較快，而后其下降速率隨時間延長而變得緩慢，超濾進行至20～30 min后，膜通量趨于穩定。

2.2.2 操作壓力對膜通量的影響

壓差是超濾過程的推動力，分別取蒸餾水和脫色后的棉子糖溶液，在40 ℃下穩定運行20 min后，調節進出口閥，在不同操作壓力下的測定膜通量。從圖3可看出，膜通量隨壓力升高而增大，而后逐漸趨于穩定，0.016 MPa后膜通量幾乎不再增大。這可能是因為隨著壓差的增大，大分子物質會不斷被溶劑帶至膜表面積累，形成由膜表面到主體溶液之間的濃度差，形成濃差極化現象。隨著濃差極化程度的加劇，膜表面的溶質質量分數急劇增加。當膜表面的質量分數達到飽和時，就在膜面形成凝膠層，產生了凝膠層阻力，此時膜通量的變化不再依賴于壓力。因此本實驗選擇操作壓力0.016 MPa。

圖2 各因素對棉子糖脫色率與收率的影響

圖3 各因素對膜通量的影響

2.2.3 料液溫度對膜通量的影響

取蒸餾水和脫色處理后的棉子糖溶液，在膜允許的溫度范圍內(5～45 ℃)調節料液的溫度，在操作壓力0.016 MPa的條件下運行20 min，測定其膜通量。由圖3可知，在超濾過程允許的工作溫度下，隨著料液溫度的升高，膜通量相應增加，溫度和膜通量速度變化基本呈線性關系。這是由于溫度升高，加快膜中聚合物鏈節的微觀布朗運動，使單位時間單位體積形成小孔的可能性增加，從而使透過速度增大，其次分子熱運動速度加快，各種分子向膜表面及其由膜表面向溶液主體擴散速度加快，即增大了傳質系數，從而提高了膜通量。而且糖溶液隨溫度升高黏度下降，溶劑更容易透過膜；蛋白質溶解度隨糖溶液溫度升高而增加，可降低膜表面對蛋白質的吸附。為了提高效率，應選擇較高的物料溫度，但操作溫度的選擇還受到膜材料耐熱性和物料熱敏性的限制，為了延長膜的使用壽命，本實驗選擇操作溫度為40 ℃。

2.2.4 pH對膜通量的影響

從圖3可以看出，當料液溫度(40 ℃)、操作壓力(0.016 MPa)均保持不變時，溶液的pH值對膜通量有較明顯的影響，與文獻[20]報道相似。在堿性條件下，膜通量較大，隨著溶液pH值減小膜通量逐漸減小，在pH值為5左右時，膜通量達到最低值，pH值再減小時膜通量又趨于增大。這種現象產生的原因可能是糖溶液中所含蛋白質中的氨基酸同時具有氨基和羧基，可解離為負電荷和正電荷基團，是一種兩性化合物，當pH為某一特殊值時所帶凈電荷為零，即蛋白質的等電點。蛋白質在等電點處其溶解度最小。由圖3可以看出，棉子糖溶液中蛋白質等電點在pH值為5左右，此時蛋白質最易析出和聚集在膜的表面，形成最緊密吸附層，對流體的阻力最大，因而膜通量最低。當溶液pH值偏離等電點時，溶液中蛋白將帶有電荷，溶質分子間的靜電排斥力變大，溶液黏度變小，膜通量增大。因此膜超濾應該在偏離等電點時進行，可將糖溶液pH調到8進行實驗。

在溫度40 ℃，壓力0.016 MPa，糖溶液pH=8下進行20 min膜超濾實驗。收集滲透液，用質量分數30%的三氯乙酸進行檢測，超濾后溶液中未檢測出蛋白質。

2.3 棉子糖的重結晶

2.3.1 重結晶料液比的確定

由圖4可知，在棉子糖粗品質量一定的情況下，棉子糖的收率與純度是相互制約的關系。在料液比較小時，析出的晶體中含有大量的棉子糖及雜質，產品的收率大，但純度較低；隨著液固比增加，溶解于溶劑中的棉子糖與雜質的質量上升，使得晶體中棉子糖的含量相對增加，因此產品的純度較高，但其收率小。綜上所述，兼顧產品的收率與純度，選擇較為合適的料液比1∶14。

圖4 重結晶因素對棉子糖收率和純度的影響(a)料液比(b)結晶時間

2.3.2 重結晶時間的確定

由圖4可以看出，隨著重結晶時間的延長，晶體的質量呈先增加后平穩的趨勢。當時間延長至24 h后，晶體的析出量已無明顯增加，同時太長的結晶時間會引起晶體結塊的現象。因此，從經濟及晶體晶型的角度考慮，確定結晶時間為24 h。

由超聲輔助雙液相溶劑萃取后所得的棉子糖溶液經硅藻土與活性炭混合物脫色、再經超濾脫蛋白、溶劑重結晶后，最終得到純度為94.5%，回收率為63.1%的棉子糖(以原料甲醇相為基點計算)。

3 結論

以雙液相溶劑(甲醇和石油醚)萃取棉籽工藝中甲醇相為原料，在預處理的基礎上，采用3%硅藻土與活性炭(混合物與糖溶液質量之比)在50℃下脫色2 h，棉子糖的收率為85.6%，脫色率為89.1%；在溫度40 ℃，壓力0.016 MPa，糖溶液pH=8下超濾膜脫蛋白20 min，可將棉子糖提取液中大分子蛋白有效地除去；在糖溶液與重結晶溶劑(丙酮-乙醇-水，體積比2∶1∶0.5)料液比為1∶14的條件下，重結晶棉子糖粗品24 h，最終得到的棉子糖產品純度為94.5%，回收率為63.1%。

該工藝與傳統的棉子糖提取工藝相比，有一些明顯優點：避免了高溫處理棉籽，保護了生物質的活性；前期萃取過程減少萃取步驟，提高萃取效率，節約能源；此工藝首次較系統、完整地研究了從原料(甲醇相)到產品(棉子糖)的提純過程；該工藝兼顧棉子糖的回收率與純度，且簡單易行。