伊絲諾輕奢煥色口紅微生物檢驗方法挑戰(zhàn)性試驗研究

（甘肅省藥品檢驗研究院 甘肅 730070）

伊絲諾輕奢煥色口紅是由辛基十二醇，辛酸/葵酸甘油三酯，二異硬脂醇蘋果酸酯，季戊四醇四異硬脂酸酯，純地蠟，辛基十二醇硬脂酰氧基硬脂酸酯，雙-二甘油多酰基己二酸酯-2，魚鯊?fù)椋垡蚁珻12-15醇苯甲酸酯，苯基聚三甲基硅氧烷，二聚季戊四醇六羥基硬脂酸酯/六硬脂酸脂/六松脂酸酯，松櫚酸乙基己酯，蜂蠟，牛油果樹（BUTYROSPERMUM PARKII）果酯，微晶蠟，小燭樹（EUPHORBIACERIFERA）蠟。生育酚乙酸酯，十三烷醇偏苯三酸酯，白池花（LIMNANTHES ALBA）籽油，胡蘿卜（DAUCUS CAROTA SATIVA）根提取物，羥苯丙酯，山梨坦油酸脂，番茄（SOLANUMLYCOPERSICUM）果提取物，氫化聚異丁烯，香精，著色劑：CI77891，CI45410，CI17200，CI16035，CI15850等組成。

化妝品微生物檢驗[1]中進行方法和限值規(guī)定，口紅類化妝品由于含有大量酯類基質(zhì)[2]，按標(biāo)準(zhǔn)方法無法進行檢驗，本文對伊絲諾輕奢煥色口紅加入指示菌[3]，進行微生物檢驗方法挑戰(zhàn)性試驗，通過計數(shù)方法回收率、控制菌生長試驗，建立伊絲諾輕奢煥色口紅微生物檢驗方法。

1.試驗材料

（1）伊絲諾輕奢煥色口紅：廣州伊絲諾化妝品有限公司（委托方），廣州伊蕾琪化妝品有限公司（被委托方），生產(chǎn)許可證號：粵妝20160108，批號：20191123。

（2）培養(yǎng)基：卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂，批號：190221；SCDLP液體培養(yǎng)基，批號：180202；孟加拉紅瓊脂，批號：180119；雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基（含中和劑），批號：180609；Baird-Parker培養(yǎng)基基礎(chǔ)，批號：190122；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基，批號：180811；伊紅美藍瓊脂（EMB），批號：190827；十六烷三甲基溴化銨瓊脂，批號：190813；pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號：20200312。均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

（3）菌種：大腸埃希菌〔ATCC8739〕、銅綠假單胞菌〔ATCC 27853〕、枯草芽孢桿菌〔ATCC 6633〕、金黃色葡萄球菌〔ATCC6538〕、白色念珠菌〔ATCC10231〕和黑曲霉〔ATCC16404〕。購于中國食品藥品檢驗研究院。

（4）設(shè)備：超凈工作臺（廠家：蘇州蘇凈，型號：SWCJ-2D型）、生物安全柜（廠家：ESCD，型號：CLASS1-1BSC）、生化培養(yǎng)箱（廠家：上海一恒，型號：BPMJ-250F）、壓力消毒器（廠家：松下，型號：MSL-3781LPC）、恒溫水浴鍋（廠家：杭州米歐儀器有限公司，型號：WT100-2）、電冰箱（廠家：江蘇白雪，型號：6C13080177）、顯微鏡（廠家：奧林巴斯，型號：BX53+DP74）、電熱恒溫干燥箱（廠家：北京科偉永興儀器有限公司，型號：101-3AB）、天平（廠家：諸暨超澤，型號：JMA5001）。

2.方法與結(jié)果

(1)菌種

試驗所用菌種為第3代，菌懸液為第4代。

(2)供試液制備

取伊絲諾輕奢煥色口紅5g加到滅菌的三角瓶中，加入5ml滅菌吐溫-80，加入pH7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液至100ml，置于45℃水浴中，溶解，用勻漿儀混勻3分鐘，制成1:20供試液。

(3)微生物檢驗計數(shù)方法驗證

①試驗組取1:20供試液，分別加入5種試驗菌株（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，制成每毫升1:10供試液含菌數(shù)小于100cfu，取含菌的樣品溶液1ml，每個菌液注2個平皿，注入所需培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計數(shù)。②菌液對照組分別取5種實驗菌的菌懸液（50～100cfu）1ml注皿，加培養(yǎng)基、培養(yǎng)、計數(shù)。③供試品對照組用供試品替代實驗組液體注皿，實驗。④陰性對照組用同批配制、滅菌的SCDLP1ml替代樣品注皿，注入培養(yǎng)基、培養(yǎng)、計數(shù)。計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果見表1。

表1 伊絲諾輕奢煥色口紅計數(shù)方法挑戰(zhàn)性試驗

結(jié)果，采用1:20的供試液1ml注皿，細菌總數(shù)、霉菌以及酵母菌總數(shù)的回收率試驗滿足要求，伊絲諾輕奢煥色口紅細菌總數(shù)、霉菌以及酵母菌總數(shù)檢驗方法可行。

(4)銅綠假單胞菌檢驗方法挑戰(zhàn)性試驗

①試驗組。取伊絲諾輕奢煥色口紅1:20的供試液20ml加入100mlSCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，加入銅綠假單胞菌菌懸液1ml（小于100cfu），按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行試驗。

②陽性對照。將銅綠假單胞菌菌懸液1 ml（小于100cfu）加到100mlSCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行檢驗；同時測定銅綠假單胞菌菌懸液菌數(shù)。

③供試品對照組。取伊絲諾輕奢煥色口紅1:20的供試液20ml加入100mlSCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行試驗。

④陰性對照。同批配制、滅菌100mlSCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行檢驗。

銅綠假單胞菌方法適用性試驗結(jié)果，見表2。

表2 伊絲諾輕奢煥色口紅-銅綠假單胞菌方法適用性試驗

結(jié)果，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版銅綠假單胞菌常規(guī)方法進行實驗，可以檢出試驗菌-銅綠假單胞菌，方法可行。

(5)金黃色葡萄球菌檢驗方法挑戰(zhàn)性試驗

①試驗組。取伊絲諾輕奢煥色口紅1:20的供試液20ml加入100mlSCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，加入金黃色葡萄球菌菌懸液1ml（小于100cfu），按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版金黃色葡萄球菌檢查項進行試驗。

②陽性對照。將金黃色葡萄球菌菌懸液1ml（小于100cfu）加到100mlSCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行檢驗；同時測定金黃色葡萄球菌菌懸液菌數(shù)。

③供試品對照組。取伊絲諾輕奢煥色口紅1:20的供試液20ml加入100mlSCDLP液體培養(yǎng)基到滅菌的三角瓶中，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行試驗。

④陰性對照。同批配制、滅菌100mlSCDLP液體培養(yǎng)基，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行檢驗。

金黃色葡萄球菌方法適用性試驗結(jié)果，見表3。

表3 伊絲諾輕奢煥色口紅控制菌-金黃色葡萄球菌方法適用性試驗

結(jié)果，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版金黃色葡萄球菌常規(guī)方法進行實驗，可以檢出試驗菌-金黃色葡萄球菌，方法可行。

(6)耐熱大腸菌群檢驗方法挑戰(zhàn)性試驗

①試驗組。取伊絲諾輕奢煥色口紅1:20的供試液20ml加入20ml雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基（含中和劑）到滅菌的試管中，加入大腸埃希菌菌懸液1ml（小于100cfu），按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版耐熱大腸菌群檢查項進行試驗。

②陽性對照。將大腸埃希菌菌懸液1ml（小于100cfu）加到20ml雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基（含中和劑），按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行檢驗；同時測定大腸埃希菌菌懸液菌數(shù)。

③供試品對照組。取伊絲諾輕奢煥色口紅1:20的供試液20ml加入20ml雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基（含中和劑）到滅菌的試管中，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行試驗。

④陰性對照。同批配制、滅菌20ml雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基（含中和劑），按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版要求進行檢驗。

耐熱大腸菌群方法適用性試驗結(jié)果，見表4。

表4 伊絲諾輕奢煥色口紅控制菌—耐熱大腸菌群方法適用性試驗

結(jié)果，采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版耐熱大腸菌群常規(guī)方法進行實驗，可以檢出試驗菌-大腸埃希菌，方法可行。

3.結(jié)論

（1）伊絲諾輕奢煥色口紅計數(shù)方法，由于口紅中含有大量脂溶性基質(zhì)，無法制備成均勻的混懸液，采用1:20的供試液注皿，細菌、真菌回收率試驗達到70%以上，方法可行。

（2）控制菌：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的生長試驗均滿足微生物檢驗的要求。挑戰(zhàn)性試驗方法可行。