正交試驗(yàn)法優(yōu)化南非葉抑菌活性成分提取工藝

黃敏桃 龐小莉 楊林芳 譚麗鳳 薛娟萍 廖顯輝 黃庶識(shí)

摘 要 利用正交試驗(yàn)法，以南非葉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性為指標(biāo)，采用超聲波提取法對(duì)南非葉提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇試驗(yàn)因素和水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察南非葉抑菌活性成分最佳提取工藝。結(jié)果表明，最佳提取工藝為：95%乙醇超聲提取2次，提取時(shí)間60 min，液料比30∶1（體積與重量比）。在此條件下提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)18.08 mm。

關(guān)鍵詞 南非葉;抑菌;活性成分;提取工藝;正交試驗(yàn)法

中圖分類號(hào)：Q503 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.34.018

南非葉為菊科斑鳩菊屬植物扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del.）的葉。扁桃斑鳩菊別名桃葉斑鳩菊、神奇葉、苦樹、苦膽葉、苦茶葉、南非樹等[1]，原產(chǎn)于熱帶非洲，在尼日利亞等地被當(dāng)作一種蔬菜[2]，尤以東南亞和臺(tái)灣等地民間應(yīng)用較多，已在藥品、食品工業(yè)等領(lǐng)域得到應(yīng)用。南非葉味苦澀，性涼，具有抗腫瘤、抗氧化、清熱解毒、散熱涼血、降血壓、降膽固醇和降血糖等多種功效[3-5]，適用于高血壓、高膽固醇、糖尿病的治療。南非葉的水煎劑具有促胃酸分泌、降血脂、抗瘧原蟲和抗癌作用[6]。東南亞民間常用南非葉治療乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥[7-8]。因此，南非葉以抗癌草藥著稱。

前人研究表明，南非葉的熱乙醇或冷乙醇提取物可以抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌的生長(zhǎng)[9]，表明南非葉具有較強(qiáng)的抗菌活性。南非葉在我國(guó)廣東、廣西、福建等地均有引進(jìn)種植，是民間常用中藥，但是相關(guān)文獻(xiàn)還未見涉及其抑菌活性研究。筆者以廣西南非葉為研究對(duì)象，采用對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果作為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)法對(duì)南非葉提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，為后續(xù)南非葉品質(zhì)研究提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試劑與材料

1.1.1? 藥材與試劑

藥材：南非葉購(gòu)于廣西玉林中藥材專業(yè)市場(chǎng)。

試劑：石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇（均為分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)），純化水。

1.1.2? 細(xì)菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach ）（ATCC26003）購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection）。

1.1.3? 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（廣東環(huán)凱公司生產(chǎn)）。

1.2? 設(shè)備

電子天平（浙江永康市五鑫衡器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），索氏提取器（上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司），數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），牛津杯（天津思利達(dá)公司），0.22 μm微孔濾膜（天津津騰公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），智能型超聲波清洗機(jī)（福州德森精工有限公司）。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1? 不同溶劑提取試驗(yàn)

稱取5 g南非葉粉末6份，分別加入石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇、純化水各150 mL，超聲波提取60 min，提取2次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復(fù)3次。

1.3.2? 提取方法試驗(yàn)

稱取5 g南非葉粉末3份，各加入95%乙醇150 mL，一份超聲波提取2 h，一份常溫浸泡24 h，一份于95 ℃索氏回流提取2 h，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復(fù)3次。

1.3.3? 提取功率試驗(yàn)

稱取5 g南非葉粉末2份，各加入95%乙醇150 mL，分別選擇20、40 kHz兩個(gè)超聲功率提取60 min，提取2次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復(fù)3次。

1.3.4? 液料比試驗(yàn)

稱取5 g南非葉粉末6份，分別加入50、100、150、200、250、300 mL的95%乙醇溶劑，20 kHz超聲波提取1 h，提取2次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復(fù)3次。

1.3.5? 提取時(shí)間試驗(yàn)

稱取5 g南非葉粉末5份，各加入150 mL的95%乙醇溶劑，20 kHz超聲波分別提取30、40、50、60、70 min，提取2次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復(fù)3次。

1.3.6? 提取次數(shù)試驗(yàn)

稱取5 g南非葉粉末4份，各加入150 mL的95%乙醇溶劑，20 kHz超聲波分別提取1、2、3、4次，過濾濃縮揮干，揮干物用甲醇定容至10 mL容量瓶備用。重復(fù)3次。

1.3.7? 杯碟法測(cè)定樣品對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用

將金黃色葡萄球菌接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯，35 ℃恒溫培養(yǎng)15～18 h至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，用無菌生理鹽水稀釋10倍，將稀釋后的菌液吸取50 ?L均勻涂布在瓊脂平板表面，稍干后將牛津杯等距離放置瓊脂表面，一個(gè)平板放置3個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯定量加入200 ?L無菌過濾后的南非葉提取液，4 ℃冰箱放置10 h使藥液擴(kuò)散，再移到35 ℃恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)藥液樣品試驗(yàn)重復(fù)3次，其平均值為抑菌結(jié)果。

1.3.8? 正交試驗(yàn)法對(duì)提取工藝的優(yōu)化

綜合各單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)條件，以南非葉抑菌圈為指標(biāo)，提取時(shí)間（50 min、60 min、70 min），液料比（20∶1、30∶1、40∶1，皆為體積與重量比，下同），提取次數(shù)（1次、2次、3次）為考察對(duì)象（見表1），重復(fù)試驗(yàn)3次。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單因素試驗(yàn)

2.1.1? 不同溶劑提取試驗(yàn)

試驗(yàn)表明，石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇和水六個(gè)處理的抑菌圈直徑分別為6、13.62、12.72、13.29、6、6 mm，可見石油醚、甲醇、水這3種試劑對(duì)金黃色葡萄球菌無明顯對(duì)抑菌作用，正丁醇、95%乙醇提取物抑菌效果最好，其次為乙酸乙酯提取物。從試劑安全性及經(jīng)濟(jì)方面綜合考慮，95%乙醇作為提取溶劑，既能達(dá)到最佳抑菌效果，且安全無污染，節(jié)約成本，因此，最后選擇95%乙醇作為提取溶劑，與Ogbulie J N等[9]研究結(jié)果一致。

2.1.2? 提取方法試驗(yàn)

通過超聲波、冷浸、索氏回流3種方法提取的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用差異較大，回流提取與超聲波提取時(shí)間均為2 h，冷浸時(shí)間較長(zhǎng)，抑菌效果順序?yàn)槌暡ǎ?3.29 mm）>索氏回流（9.73 mm）>冷浸（6 mm）。可能的原因是，超聲波在快速振蕩情況下，其空化作用對(duì)細(xì)胞膜起到破壞從而有助于有效成分溶出釋放，避免有效成分因受熱引起破壞。而回流提取通過加熱促使有效成分溶出，因此比冷浸提取抑菌效果好，但是可能由于溫度過高，部分成分被破壞，抑菌效果整體比超聲波低。超聲波提取法作為常見的一種提取方法，操作簡(jiǎn)便，成本較低。前人研究表明，超聲波對(duì)南非葉總黃酮、多酚等成分具有良好的提取效果[10-11]，而總黃酮類化合物具有明顯抑菌作用。因此，后續(xù)的南非葉提取方法研究選擇超聲波提取法。

2.1.3? 提取功率試驗(yàn)

20 kHz條件下南非葉提取物抑菌活性較好，40 kHz情況下也具有抑菌效果，20 kHz、40 kHz功率的抑菌圈直徑分別為15.15、13.31 mm。超聲波功率越高，在提取過程中會(huì)不斷產(chǎn)生熱量，溫度提高，可能對(duì)部分成分產(chǎn)生破壞，影響效果。因此選擇提取功率為20 kHz。

2.1.4? 液料比試驗(yàn)

由圖1可知，液料比30∶1的提取效率最高，抑菌圈達(dá)到17.53 mm。95%乙醇量繼續(xù)增加，反而抑菌效果減弱，可能存在試驗(yàn)誤差等客觀因素。綜合考慮節(jié)約溶劑等，采用30∶1的液料比進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.5? 提取時(shí)間試驗(yàn)

由圖2可知，隨著時(shí)間增加，整體上南非葉提取物抑菌活性增強(qiáng)，在40 min時(shí)有下降趨勢(shì)，可能存在試驗(yàn)誤差，50～70 min時(shí)間內(nèi)呈緩慢上升趨勢(shì)，三個(gè)時(shí)間段抑菌效果相差不明顯，抑菌圈直徑相差僅約0.3 mm，結(jié)合相關(guān)南非葉提取時(shí)間約60 min研究結(jié)果 [11]，考慮節(jié)約時(shí)間成本，認(rèn)為提取時(shí)間為60 min較合適。

2.1.6? 提取次數(shù)試驗(yàn)

試驗(yàn)表明，提取次數(shù)1、2、3、4次的抑菌圈直徑分別為14.69、17.52、17.68、17.58 mm。綜合考慮成本等因素，以提取2次的抑菌效果最好，提取次數(shù)增加，抑菌效果增加不明顯。因此，采用提取2次進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化。

2.2? 正交試驗(yàn)

表2結(jié)果顯示，對(duì)南非葉提取物抑菌效果的影響順序?yàn)樘崛r(shí)間（A）>液料比（B）>提取次數(shù)（C）。方差分析結(jié)果（見表3）表明，提取時(shí)間影響效果更加顯著，另外兩個(gè)因素影響相對(duì)較小。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定A2B2C2為最佳提取條件，即提取時(shí)間60 min，液料比30∶1，提取次數(shù)2次。

2.3? 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用超聲波提取法，以95%乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間60 min，液料比30∶1，提取2次，此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證（見表4）。結(jié)果表明，正交試驗(yàn)法優(yōu)化得到的南非葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果穩(wěn)定。

3? 結(jié)論與討論

超聲波提取方法簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、效率高，能夠使南非葉粉末在高頻率振蕩過程中充分溶解出有效活性成分，同時(shí)避免因高溫加熱而引起部分活性成分被破壞失效等問題，是一種理想的常用提取方法。根據(jù)研究結(jié)果，南非葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性成分最佳提取工藝為：95%乙醇超聲波提取2次，提取時(shí)間60 min，液料比30∶1（體積與重量比），在此條件下抑菌圈直徑為18.08 mm，RSD值為0.64%，說明提取工藝條件穩(wěn)定、可行，可為后續(xù)進(jìn)一步研究提供參考。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）

收稿日期：2021-08-12

基金項(xiàng)目：廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2019KY1415）;廣西教育廳科技項(xiàng)目“廣西職業(yè)教育林業(yè)技術(shù)專業(yè)（群）發(fā)展研究基地”（桂教職成〔2019〕63號(hào)）;廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃（0992003A-20）。

作者簡(jiǎn)介：黃敏桃（1987—），女，廣西南寧人，碩士，講師，主要從事中藥質(zhì)量控制研究。E-mail：897353853@qq.com。

*為通信作者，E-mail：hshushi@gxas.cn。