新型冠狀病毒肺炎患者肺泡灌洗液細胞蠟塊制作體會

張 亮，馬志園，李 慢，周新剛，陳佳敏，王 鵬

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)是2019年新出現的急性呼吸道傳染病，臨床表現輕重不一。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)傳染性極強，人群普遍易感[1]。目前，我國已將該病納入中華人民共和國傳染病防治法規定的乙類傳染病，因其具有較強的傳染性，故采取甲類傳染病的預防和控制措施。對于重癥的COVID-19患者，支氣管鏡技術可以清除痰液、改善通氣、糾正缺氧，還可以獲取肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagr fluid, BALF)，進行細胞病理學分析，明確有無特殊感染，為臨床治療提供重要依據[2]。但是BALF的細胞學涂片常因細胞形態結構不典型、細胞蛻變以及不能進行免疫組化檢測等導致診斷的局限性。通過制作細胞蠟塊、完善特殊染色及免疫組化檢測可使病理診斷更精準化。但是COVID-19患者的BALF具有較強的傳染性，需要在標本轉運及制作過程中采取科學、嚴謹的防護措施。本實驗對原有標本的轉運及細胞蠟塊制作方法進行優化，避免發生實驗室人員感染，保障COVID-19患者細胞蠟塊制作的安全完成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 2020年2～5月首都醫科大學附屬北京地壇醫院重癥監護病房收治的14例COVID-19患者BALF標本。

1.1.2主要試劑 10%中性福爾馬林、HE染液購自北京益利公司，AB-PAS染液購自廣州安必平公司，CK、二抗顯色系統購自Leica公司。

1.1.3主要儀器 Thermo Excelsior ES 脫水機，Leica ST5020染色機，Leica Bond全自動免疫組化染色機。

1.2 方法

1.2.1防護方法 一級防護，穿工作服、工作鞋，戴醫用帽子、外科口罩、乳膠手套；二級防護，穿工作服、隔離衣、鞋套、戴N95口罩、乳膠手套、醫用帽子；三級防護，在二級防護的基礎上穿連體防護服，佩戴護目鏡或面罩。

1.2.2標本采集 檢查人員參照三級防護標準，患者局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣管分支開口，經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水進行灌洗，并取樣放置于無菌保存瓶中。

1.2.3標本轉運 用75%乙醇對保存瓶噴霧消毒后放入帶有生物安全標識的密封袋中；用75%乙醇對密封袋噴霧消毒，將密封袋放入轉運桶內，防止保存瓶倒立、傾斜；用75%乙醇對轉運桶噴霧消毒，將轉運桶放入生物安全轉運箱內；用75%乙醇對生物安全轉運箱噴霧消毒。轉運人員穿工作服將標本經指定路線送至P2+實驗室(加強型二級生物安全實驗室)。

1.2.4BALF前處理 操作人員參照三級防護標準，在生物安全柜內檢查標本有無泄露并核對患者信息。將采集的BALF放入水浴鍋中，56 ℃滅活30 min后轉移至50 mL離心管內，3 000 r/min離心5 min，將上清液倒入廢液桶內，加入20 mL 10%中性福爾馬林，固定2 h以上。參照標本轉運方法，將固定后的BALF轉運至病理科。

1.2.5病理科接收 接收人員參照二級防護標準，用75%乙醇對生物安全轉運箱、轉運桶、密封袋、離心管依次噴霧消毒后取出。

1.2.6細胞蠟塊制作 操作人員參照二級防護標準將固定后的BALF以3 000 r/min離心5 min，將上清液倒入廢液桶內，加入正常人血漿200 μL、95%乙醇5 mL，使用震蕩儀器，將液體與沉淀物充分混勻，靜置15 min后，3 000 r/min離心5 min，棄掉上清液至廢液桶內，輕輕敲擊離心管管壁，使凝固成塊的細胞團從離心管底脫落，用包埋紙打包放入包埋盒中，置入脫水機中參照小標本處理程序過夜，次日包埋成蠟塊。

1.2.7切片及染色 參照一級防護標準，在常規技術室進行4 μm厚連續切片3張，行HE染色(采用Leica ST5020染色機)、AB-PAS染色(嚴格遵守試劑盒說明書操作流程)、免疫組化CK染色(采用Leica Bond全自動免疫組化染色機)。

1.2.8醫療廢物處理 實驗過程中產生的廢液采用550 mg/L的有效氯浸泡，作用時間60 min以上，其它固體廢物和防護用品視為高危醫療廢物，放入專用黃色垃圾袋，并注明“新冠高危醫療廢物”標識，密封交至后勤工作人員，根據《醫療廢物處理條例》和《醫療衛生機構醫療廢物管理辦法》的有關規定進行處置和管理。

2 結果

2.1 實驗室安全本實驗于56 ℃下對BALF滅活30 min，再采用10%中性福爾馬林處理，在生物安全二級防護措施下進行細胞蠟塊制作，未發生實驗室人員感染。

2.2 細胞數量鏡下觀察12例細胞量豐富(圖1)，2例細胞量較少，僅在邊緣有少量細胞存在(圖2)。

2.3 形態學染色HE染色，薄厚均勻，細胞無變形，核質對比清晰；AB-PAS染色顯示酸性黏液呈藍色(圖3)；免疫組化染色CK顯示上皮細胞陽性(圖4)。

圖1 黏液背景下可見少量呼吸上皮細胞及炎細胞 圖2 細胞蠟塊，僅在邊緣有少量細胞存在 圖3 酸性黏液呈藍色，AB-PAS染色 圖4 CK染色顯示呼吸上皮細胞陽性，EnVision法

3 討論

SARS-CoV-2屬于β屬的冠狀病毒，基因特征與SARSr-CoV和MERSr-CoV有明顯區別，其傳播途徑主要包括飛沫、接觸、空氣傳播，氣溶膠傳播是實驗室常見的傳播方式。病毒對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑，均可有效滅活病毒[3]。目前，研究發現重型COVID-19患者白細胞、中性粒細胞和降鈣素原水平明顯高于普通型患者，提示患者可以合并特殊感染[4]。

細胞蠟塊技術已經廣泛應用于胸、腹水等制作，已經證實其相對于傳統涂片具有更高的病理診斷價值[5-6]，但COVID-19患者等具有高傳染性體液標本的細胞蠟塊制作流程尚未有報道。作者在標本轉運及接收時，采用三層包裝，并逐層用75%乙醇進行噴霧消毒，降低病毒暴露風險；在P2+實驗室內，首先將BALF標本放入水浴鍋中56 ℃滅活30 min，然后通過離心獲取細胞濃縮液，加入10%中性福爾馬林，在保持細胞原有結構的同時可以增強對病毒的滅活作用；為避免紙質接觸傳染，采用電子病理申請單及電子病理報告，避免紙質在手術室、隔離病區、病理科傳播，降低接觸傳播的幾率。經過以上措施進行細胞蠟塊制作，未發生實驗室人員感染。

在細胞蠟塊的制作過程中，因血漿中含有豐富蛋白，與乙醇混合后可發生凝固，使細胞凝聚成團塊[7]，脫水機處理后包埋成蠟塊，對蠟塊進行連續切片和染色，鏡下觀察細胞量豐富，細胞無變形，核質對比清晰，特殊染色及免疫組化定位準確，陽性信號強，且無非特異性著色。其中2例BALF肉眼可見其呈透明樣，鏡下觀察細胞量較少，對于此類標本，可采用50 mL離心管離心后，取濃縮液轉移至1.5 mL離心管，加入100 μL正常人血漿及100 μL 95%乙醇，3 000 r/min離心5 min，再繼續蠟塊制作，可增加細胞數量。

相對于傳統涂片，細胞蠟塊可以永久保存，重復制片，進行特殊染色、免疫組化、分子檢測等有助于提高病理診斷的精準性，同時易于進行回顧性分析。COVID-19患者的BALF因具有較強的傳染性，在操作過程中，每個環節均應嚴格遵循生物安全防控制度，同時科室應對全員進行防護培訓，對重點崗位的實驗人員重點培訓，使其熟練掌握COVID-19的防控知識、方法與技能，避免在細胞蠟塊制作過程中發生院內感染。因此，對于類似高傳染性體液標本的轉運及制片，本實驗均具有借鑒意義。