酶標羊抗兔聚合物中加入不同表面活性劑對免疫組化染色強度的影響

陳 玲，梁永波，李 莉，劉玲玲，齊 華

在臨床病理診斷和形態學研究中，免疫組化是病理科主要的輔助診斷技術之一，對疾病診斷、預后判斷、靶向治療相關指標的檢測指導臨床用藥、了解發病機制和檢測病原體等方面起重要的作用[1-2]。免疫組化整體染色步驟繁瑣，每一步驟所用試劑及操作方法均可能影響染色效果，本文主要探索向酶標羊抗兔聚合物中添加不同表面活性劑對免疫組化染色強度的影響，以期篩選出對免疫組化染色效果具有正向作用的輔助試劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料組織蠟塊來自于賽諾特醫學檢驗所，3 μm厚切片。

1.2 試劑Tris-EDTA抗原修復液(pH 9.0)，抗體p40(克隆號ZR8)，CK5(克隆號C9E33)，內源性過氧化物酶阻斷劑，分別含0.2%Saponin、0.2%Tritoon-100和0.2%Nonidet P-40的酶標羊抗兔(Microstacker)聚合物，以上試劑來自河南賽諾特公司EnVision檢測系統及DAB免疫顯色劑(Dako公司)；以上所有試劑均為即用型。輔助試劑：75%、85%、95%和100%乙醇；透明試劑二甲苯；封片膠等。

1.3 實驗步驟(1)常規免疫組化脫蠟至水。(2)使用高壓鍋抗原修復法修復；待鍋中液體自然冷卻至室溫后取出切片，蒸餾水浸泡5 min×2次，使用免疫組化油筆對待測組織進行畫圈，將待測組織全部包含在圈內。(3)加過氧化物酶封閉劑，室溫孵育5 min，置于PBS清洗液5 min×2次。(4)一抗孵育：室溫60 min，置于PBS清洗液5 min×2次。(5)二抗孵育：室溫30 min(含 Nonidet P-40、Saponin、Trition-100的酶標羊抗兔聚合物和Dako公司EnVision檢測系統HRP，置于PBS清洗液5 min×2次。(6)顯色，滴加100 μL DAB顯色液，孵育5 min，純化水沖洗；(注意：顯色液需要現配現用)。(7)復染：蘇木精復染液孵育5 min，再用純化水沖洗并浸泡5 min。(8)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結果

在酶標羊抗兔聚合物中分別加入0.2%Saponin、0.2%Trition-100和0.2%Nonidet P-40三種表面活性劑，發現含Saponin和Trition-100的實驗處理在p40(胞核)項目中能夠增強染色，而含Nonidet P-40的實驗處理卻使p40(胞核)染色強度減弱，但對CK5(胞質)的染色強度未表現出明顯差異性(圖1)。

圖1 p40為同一肺組織石蠟切片，Nonidet P-40組染色強度減弱，CK5為同一子宮頸組織石蠟切片，各組染色強度一致

3 討論

準確的病理診斷依賴于可靠的技術支撐，因此對免疫組化技術的質量控制至關重要，實驗過程中不僅需要選擇合適的抗原修復液及修復方式，過硬的抗體及酶標抗體的質量來確保免疫組化染色質量[3-5]，同時也希望通過添加一些輔助試劑來提高免疫組化染色強度及背景清晰度，為病理醫師的診斷提供方便。本文通過向酶標羊抗兔聚合物中添加不同種類的表面活性劑，實驗結果顯示添加Saponin或Trition-100表面活性劑染色p40(胞核)能夠增強染色強度，而添加Nonidet P-40則使p40染色強度減弱，但是對CK5(胞質)染色差異均無顯著性。分析原因可能是由于Saponin茶皂素是一種純天然非離子型表面活性劑，Trition-100是一種黃色黏稠狀液體的表面活性劑；Saponin茶皂素和Trition-100均能夠溶解脂質，增加細胞通透性，進而有利于抗體滲入到細胞核內與相應的抗原結合導致核表達的陽性細胞數量增加染色強度增強；但是對細胞膜/細胞質的著色并無明顯差異[6]。Nonidet P-40是一種無離子去垢劑，與蛋白結合能力強，可與細胞膜上的蛋白結合阻礙抗體順利滲入細胞核內與相應的抗原結合而減弱核表達強度，同樣對細胞膜、細胞質上未表現出明顯強度差異。