改良Hale膠體鐵組合染色用于杯狀細胞染色效果

丁桂齡，鄭建明，劉艷芳，蔣 慧

腸道是人體內極為重要的器官，不僅具有消化吸收營養物質和產生多種激素的作用，還具有重要的免疫屏障功能。腸道黏膜表面覆蓋著一層保護性黏液凝膠，該凝膠及其周邊的多種細胞通過病理生理機制共同參與維持腸道穩態。杯狀細胞是腸道黏膜免疫屏障功能中產生免疫應答反應的重要細胞，其分化和分泌功能的改變可導致黏液凝膠成分的改變，在腸道疾病的發生、發展過程中扮演著重要角色。作者經過實踐，采用改良Hale膠體鐵組合染色法，可較好地顯示腸道組織中的杯狀細胞，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取海軍軍醫大學附屬長海醫院病理科存檔的十二指腸和結腸手術切除標本合計10例，所有標本均經10%中性福爾馬林固定后取材，行常規流程制成3 μm厚石蠟切片，75 ℃烤臺烤片20 min。

1.2 試劑及配制(1)膠體鐵原液：30%氯化鐵5 mL，蒸餾水250 mL。先將盛有250 mL蒸餾水的加蓋燒杯置于電磁爐上加熱使液體沸騰，然后向燒杯內滴加30%氯化鐵5 mL，待溶液變成磚紅色后停止加熱，最后將燒杯轉移至磁力攪拌器上，直至溶液變成混勻且均一的磚紅色，待液體冷卻后，將其存放于棕色試劑瓶中于室溫下保存。(2)膠體鐵染液：膠體鐵原液20 mL，乙酸5 mL，蒸餾水15 mL。為顯示實驗效果，本實驗采取染液臨用前新配制，其pH值調整為1.4。(3)乙酸液：乙酸3 mL，蒸餾水100 mL。(4)亞鐵氰化鉀鹽酸液：5%亞鐵氰化鉀水溶液15 mL，5%鹽酸15 mL，臨用前新配制。(5)麗春紅苦味酸染色液：0.5%麗春紅S水溶液10 mL，苦味酸飽和水溶液90 mL。

1.3 方法組織切片經脫蠟至水，入乙酸液浸洗2 min。先直接浸入盛有膠體鐵染液的立式染色缸中40 min，再浸入乙酸液浸洗3 min，而后浸入盛有亞鐵氰化鉀鹽酸液的立式染色缸中10 min。自來水洗2 min，0.5%麗春紅苦味酸S水溶液滴染3 min，無水乙醇脫水，冷風干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結果

染色后腸道黏膜中分布數量不等的杯狀細胞，呈藍色或深藍色；頂部胞質內的黏蛋白呈淡藍色或深藍色；膠原纖維呈粉紅色；染色鮮明，鏡下易辨認，背景色理想(圖1～3)。

圖1 乙狀結腸杯狀細胞(紅箭頭)呈藍色或深藍色，膠原纖維(黑箭頭)呈紅褐色，改良Hale膠體鐵組合染色 圖2 乙狀結腸杯狀細胞(紅箭頭)呈藍色或深藍色，改良Hale膠體鐵組合染色 圖3 十二指腸杯狀細胞(紅箭頭)呈藍色或深藍色，頂部胞質內的黏蛋白呈淡藍色(黃箭頭)，吸收細胞(紫箭頭)呈亮白色，改良Hale膠體鐵組合染色

3 討論

杯狀細胞分泌的黏蛋白可與水、無機鹽等結合形成附著在腸黏膜表面的黏液層，黏液層與腸上皮細胞、腸道微生態和宿主的免疫系統相互作用，共同維持腸道內環境的穩態[1]，并參與多種腸道疾病的發生、發展。臨床病理工作中多數工作者首選杯狀細胞的染色方法多為PAS染色或阿爾辛藍染色。對于PAS染色，作者實際操作中發現該染色法著染的成分較多，不僅對于基膜、真菌、糖原、十二指腸腺等均能著色，還會在操作欠妥下造成組織整體一片紅染，該染色法的特異性和對比度有待再實踐。對于阿爾辛藍染色，雖實際操作簡單且也可顯示杯狀細胞，但作者及部分同行在實際操作中發現，其對杯狀細胞的著色較淡，這不排除不同單位采購試劑質量和濃度的差異。改良Hale膠體鐵組合染色能較好地顯示杯狀細胞，這可能與杯狀細胞自身結構及其分泌物的成分有關。杯狀細胞是一種典型的黏液細胞，其主要成分黏蛋白在酸性條件下能吸附膠體鐵染液中的Fe3+而形成穩定的聚合物，再與亞鐵氰化鉀鹽酸結合而牢固著色[2]。改良法有以下特色：(1)膠體鐵原液配置的過程，更改了不僅費時費力、還有液體飛濺可能的手動搖晃方式，借助磁力攪拌器，即節省了人力、又保證了實驗安全、還能較好地混勻液體。(2)將原始方法中3%亞鐵氰化鉀和3%鹽酸的濃度均提高到5%，可以更快地激活杯狀細胞分泌的黏蛋白物質，促進染色反應的進行，染色后的杯狀細胞清晰可見。這可能是因為杯狀細胞的分泌物黏蛋白包含的酸性黏多糖物質作為反應基礎，在適當的酸性條件下能吸附膠體鐵染液中的Fe3+而形成穩定的、有較高電子密度的聚合物[3]，再與5%亞鐵氰化鉀鹽酸作用，杯狀細胞內的酸性黏多糖物質被牢固結合，從而能對杯狀細胞較好地著色。(3)組合染色選用0.5%麗春紅苦味酸S水溶液，既可以區分膠原纖維和肌纖維、增強整體染色的色澤度，又可以較好地觀察杯狀細胞與其毗鄰組織的形態關系，還可以輔助臨床病理中有關腸壁纖維化等疾病的診斷。染色過程中：切片需處于酸性條件下，乙酸液浸洗必須充分；為保證有足夠的染色液反應和切片著色均勻，膠體鐵染液和亞鐵氰化鉀鹽酸液必須現用現配，該步驟的染色反應建議在干凈的立式染色缸中進行。

綜上所述，改良Hale膠體鐵組合染色法對于杯狀細胞的顯示，特異性強，敏感性高，定位準確，結果易于判讀。