加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)技術(shù)對HE染色淋巴瘤核固縮的影響

陳余朋，張 聲，唐堅清

淋巴瘤的治療效果依賴于正確的病理診斷，而正確的病理診斷離不開優(yōu)良的組織切片[1]。優(yōu)良的淋巴瘤組織切片表現(xiàn)為切片薄、細(xì)胞無重疊、細(xì)胞核及染色質(zhì)形態(tài)清晰等。在日常病理診斷工作中，有少部分的淋巴瘤標(biāo)本，由于前期組織處理不佳，HE染色后出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞核固縮現(xiàn)象，造成病理診斷和分型困難。近年有研究采用加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)來解決HE染色發(fā)灰現(xiàn)象。關(guān)于采用加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)來解決細(xì)胞核固縮問題，目前文獻(xiàn)報道較少。本文采用加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)技術(shù)解決HE染色淋巴瘤中細(xì)胞核固縮現(xiàn)象，探討其臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1～12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外檢及外院送檢會診，因組織前期處理不佳的淋巴瘤標(biāo)本8例(包括組織固定欠佳5例、組織干涸1例、脫水不足2例)，均為HE染色時出現(xiàn)細(xì)胞核固縮現(xiàn)象標(biāo)本。

1.2 儀器設(shè)備Leica RM2245石蠟切片機(jī)、蘇泊爾高壓鍋、耐高溫塑料染色架、美的電磁爐、Leica ST5020全自動HE染色儀。

1.3 試劑檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)、Tris-EDTA(pH 9.0)抗原修復(fù)液、Mayer蘇木精染色液、醇溶性伊紅、1%鹽酸乙醇。

1.4 方法(1)本實驗分為五組，每一批次實驗五組切片均為同一組織，第一組為對照組，脫蠟水化后組織切片無需修復(fù)；第二組為酸性高壓組，組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已煮沸檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，蓋緊鍋蓋，高壓噴氣2 min，自然冷卻；第三組為堿性高壓組，組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已煮沸的Tris-EDTA(pH 9.0)抗原修復(fù)液中，蓋緊鍋蓋，高壓噴氣2 min，自然冷卻；第四組為酸性水浴組，組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已煮沸的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)抗原修復(fù)液中，電磁爐調(diào)節(jié)到保溫狀態(tài)，蓋好鍋蓋，熱孵育20 min，自然冷卻；第五組為堿性水浴組，組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已煮沸的Tris-EDTA(pH 9.0)抗原修復(fù)液中，電磁爐調(diào)節(jié)到保溫狀態(tài)，蓋好鍋蓋，熱孵育20 min，自然冷卻；(2)將五組切片放入Leica ST5020全自動HE染色儀中染色，Mayer蘇木精染色液染10 min，水洗；1%鹽酸乙醇分化10 s；流水沖洗返藍(lán)5 min；伊紅染1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.5 結(jié)果判讀由兩位病理醫(yī)師對HE染色切片進(jìn)行雙盲式閱片，參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊》[2]標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)實際情況制定評分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞大小合適(2分)；細(xì)胞核無固縮現(xiàn)象(3分)；腫瘤性大細(xì)胞與背景反應(yīng)性小細(xì)胞分界清楚(3分)；細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對比清晰(2分)。HE染色切片優(yōu)≥8分，良為6～7分，差≤5分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用Fisher精確概率法分析比較4種處理方法與對照組HE染色效果的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組切片HE染色形態(tài)觀察HE染色結(jié)果，對照組8例淋巴瘤鏡下HE染色形態(tài)均出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，嚴(yán)重影響正確的病理診斷(圖1)。酸性高壓組HE染色優(yōu)良率為87.5%(7/8)(圖2)，堿性高壓組HE染色優(yōu)良率為37.5%(3/8)(圖3)，酸性水浴組HE染色優(yōu)良率為25%(2/8)，堿性水浴組HE染色優(yōu)良率為25%(2/8)(圖4)，HE染色優(yōu)良率酸性高壓組優(yōu)于堿性高壓組，酸性水浴組與堿性水浴組染色結(jié)果較一致，酸性高壓組能很好地恢復(fù)淋巴瘤核固縮現(xiàn)象。

2.2 Fisher精確概率法檢驗五種處理方法HE染色結(jié)果評分四種處理方法與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，優(yōu)于對照組，以酸性高壓組處理優(yōu)良率最高(P<0.05，表1)。

表1 五種處理方法HE染色效果差異性比較

圖1 對照組：組織明顯固縮，腫瘤細(xì)胞及背景反應(yīng)性淋巴細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)紅染，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核形態(tài)無法觀察(紅箭頭為定位血管，黑箭頭疑為腫瘤細(xì)胞) 圖2 酸性高壓組：細(xì)胞大小合適，腫瘤細(xì)胞及背景反應(yīng)性淋巴細(xì)胞核染色質(zhì)形態(tài)清晰，腫瘤細(xì)胞及背景細(xì)胞形態(tài)差異明顯，可見泡狀核及嗜酸性大核仁(紅箭頭為定位血管，黑箭頭為腫瘤性大細(xì)胞) 圖3 堿性高壓組：腫瘤細(xì)胞及背景反應(yīng)性淋巴細(xì)胞均呈腫脹狀態(tài)，染色質(zhì)形態(tài)欠清晰，腫瘤細(xì)胞及背景細(xì)胞形態(tài)差異不明顯，細(xì)胞核形態(tài)觀察不清(紅箭頭為定位血管，黑箭頭疑為腫瘤細(xì)胞) 圖4 堿性水浴組：腫瘤細(xì)胞及背景反應(yīng)性淋巴細(xì)胞腫脹，細(xì)胞擁擠界限不清，細(xì)胞核水腫，腫瘤性大細(xì)胞與背景反應(yīng)性淋巴細(xì)胞分界不清，細(xì)胞核形態(tài)無法觀察(紅箭頭為定位血管，黑箭頭疑為腫瘤細(xì)胞)

3 討論

良好的組織切片、免疫組化染色、可靠的流式細(xì)胞學(xué)和分子遺傳學(xué)檢測結(jié)果是淋巴瘤診斷、鑒別診斷和WHO分子分型的重要因素和確保正確病理診斷的基礎(chǔ)[1]。淋巴瘤的診斷和分型前提是依據(jù)細(xì)胞的形態(tài)、大小、胞質(zhì)顆粒、核質(zhì)比例、核分裂、核膜、核染色質(zhì)、核仁等細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)變化，因此制備一張優(yōu)質(zhì)的HE染色切片非常重要。在日常的病理工作中，由于組織的前期處理不佳[3]，包括組織干涸、固定不及時、固定液濃度不合適、固定不充分、組織脫水、透明、浸蠟、包埋等原因，造成淋巴瘤的細(xì)胞核及染色質(zhì)固縮，嚴(yán)重影響病理診斷和分型。

目前有研究發(fā)現(xiàn)，加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)技術(shù)[4]除了用于恢復(fù)遮蔽的抗原外，還可以用于解決HE染色中細(xì)胞核染色淡和灰染現(xiàn)象。滕孝靜等[5]針對骨髓活檢組織HE染色時出現(xiàn)細(xì)胞核灰染現(xiàn)象，采用高壓修復(fù)和微波修復(fù)后，骨髓各系細(xì)胞染色鮮艷，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)形態(tài)清晰可見，對比度好。汪曉軍等[6]對固定不良、浸蠟溫度過高、時間過久，引起HE染色出現(xiàn)細(xì)胞核灰染的病例，采用熱誘導(dǎo)修復(fù)，修復(fù)液為檸檬酸鹽緩沖液、PBS、EDTA，三種修復(fù)液修復(fù)切片均能使整個組織細(xì)胞的基本形態(tài)清晰可見，核、質(zhì)染色形成鮮明的對比。以PBS為修復(fù)液，HE染色效果最佳。翁密霞等[7]對組織干涸或固定脫水不足，引HE染色發(fā)灰的石蠟蠟塊，經(jīng)EDTA抗原修復(fù)液高壓處理的切片，整個細(xì)胞的基本形態(tài)清晰可見，核、質(zhì)染色對比鮮明，清晰度好，而未經(jīng)處理的對照組染色灰暗。同時本實驗室在免疫組化染色的過程中發(fā)現(xiàn)，HE染色導(dǎo)致細(xì)胞核和染色質(zhì)固縮病例，經(jīng)過檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)的切片，免疫組化染色結(jié)果顯示細(xì)胞核很清晰，無固縮現(xiàn)象。上述發(fā)現(xiàn)給我們提供新思路，或許也可通過類似的抗原修復(fù)方法來解決由于前期標(biāo)本處理欠佳引起的HE染色切片中細(xì)胞核固縮問題。

本實驗分為五組：對照組、酸性高壓組、堿性高壓組、酸性水浴組、堿性水浴組，經(jīng)抗原修復(fù)后行HE染色。實驗結(jié)果顯示，酸性高壓組HE優(yōu)良率大大高于其它組別。作者認(rèn)為，其原因一方面與抗原修復(fù)溫度有關(guān)[8]，檸檬酸鹽緩沖液和Tris-EDTA高壓修復(fù)溫度為120 ℃，檸檬酸鹽緩沖液和Tris-EDTA水浴法溫度為100 ℃，經(jīng)過加熱抗原修復(fù)，破壞細(xì)胞間的粘連，增加細(xì)胞間的通透性，有利于水分滲入，恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)。另一方面與抗原修復(fù)液的pH值和離子強(qiáng)度有關(guān)[8]，加熱處理能夠切斷多肽和核酸中羥甲基團(tuán)的分子交聯(lián)，使多肽在組織中得以延伸。在堿性或酸性且低離子強(qiáng)度的溶液中，大多數(shù)延伸的多肽均被賦予正電荷或負(fù)電荷，相互之間產(chǎn)生靜電排斥力，這些靜電排斥力能阻止鄰近的多肽隨機(jī)聚集和纏結(jié)，因此有利于固縮的細(xì)胞得以舒展。五組染色結(jié)果比較分析，提示可以采用高溫高壓抗原修復(fù)。實驗結(jié)果顯示，酸性高壓組優(yōu)良率高于堿性高壓組。同時提示修復(fù)液pH值對修復(fù)效果可能有影響，但pH值有效范圍及是否與修復(fù)液的滲透壓有關(guān)，待后續(xù)實驗進(jìn)一步探究。

本組病例數(shù)不多，只完成淋巴瘤標(biāo)本細(xì)胞核固縮問題的分析，具有一定的局限性，在以后的工作中，需收集更多病例進(jìn)一步驗證。

總之，采用pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)，方便快捷，能有效改善由于組織前期處理不佳，包括組織固定欠佳、組織干涸、脫水不足等，而導(dǎo)致的細(xì)胞核固縮問題，可以推薦用于臨床病理工作中。