建立優(yōu)化的術(shù)中快速免疫組化檢測(cè)體系

高少陽(yáng)，王明偉，張 盛，岳君秋，常 青

術(shù)中快速病理診斷是輔助臨床醫(yī)師在術(shù)中明確腫瘤良惡性、決定手術(shù)方式的重要手段，病理切片經(jīng)HE染色在鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、組織學(xué)特征，并進(jìn)行快速診斷。由于HE染色切片因其自身局限性、制片過(guò)程中造成假象等可能導(dǎo)致誤診，難以確診疑難病例，有較大的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)中對(duì)冷凍切片進(jìn)行快速免疫組化染色，可提高術(shù)中快速病理診斷的準(zhǔn)確性。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的術(shù)中快速病理診斷在技術(shù)步驟、效果、時(shí)長(zhǎng)、成本等各有優(yōu)缺點(diǎn)[1-3]。本科室在實(shí)踐工作中建立快速手工免疫組化檢測(cè)體系，用于術(shù)中輔助診斷疑難病例，取得良好效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集16例冷凍切片(經(jīng)HE染色難以確診的疑難病例)，其中10例乳腺導(dǎo)管原位癌伴/不伴微小浸潤(rùn)，3例乳腺硬化性腺病，3例低分化癌。另收集2例乳腺纖維腺瘤作為對(duì)照，留取組織標(biāo)本或切片進(jìn)行術(shù)中快速免疫組化染色。

1.2 試劑(1)實(shí)驗(yàn)室自配AAF固定液(95%乙醇85 mL、甲醛10 mL、乙酸5 mL)，PBS緩沖液(pH 7.3，北京中杉金橋公司)。(2)快速免疫組化一抗和石蠟切片免疫組化一抗試劑詳見表1、2。二抗顯色系統(tǒng)采用EnVision FLEX酶標(biāo)二抗及DAB工作液；p63、CKpan采用Leica BOND-MAX全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行染色，二抗及顯色系統(tǒng)為L(zhǎng)eica Bond顯色試劑套裝；Calponin采用DAKO自動(dòng)染色機(jī)Link48和EnVision FLEX檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行染色。

1.3 主要儀器全自動(dòng)免疫組化儀BOND-MAX/Leica，Autostainer Link48/DAKO等。

1.4 方法

1.4.1術(shù)中快速手工免疫組化 (1)新鮮組織于-20 ℃速凍后4～6 μm厚切片，固定液(AAF或冷丙酮)固定1 min，經(jīng)PBS沖洗5 s，丙酮固定組織室溫晾干5～10 s；(2)滴加一抗于37 ℃孵育5 min，PBS沖洗5 s×3次；(3)滴加酶標(biāo)二抗試劑37 ℃孵育5 min，PBS沖洗5 s×3次；(4)DAB顯色37 ℃ 1 min，水洗5 s；(5)蘇木精復(fù)染8～10 s，水洗5 s；(6)梯度脫水，封固。

表1 術(shù)中快速免疫組化一抗試劑

表2 石蠟切片免疫組化一抗試劑

1.4.2術(shù)后石蠟切片全自動(dòng)免疫組化 術(shù)中快速制片的組織以及剩余組織再取材，均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，梯度脫水、透明浸蠟、石蠟包埋、制片、脫蠟、高壓修復(fù)后，行免疫組化EnVision法染色，具體染色步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 不同固定液的比較本實(shí)驗(yàn)選用術(shù)中新鮮取材的乳腺導(dǎo)管原位癌組織行p63和Calponin檢測(cè)，選用低分化癌組織進(jìn)行CKpan檢測(cè)；同一組織切片后分別用AAF和冷丙酮進(jìn)行固定，再行免疫組化EnVision法染色。結(jié)果顯示：兩組切片中p63(圖1)、Calponin和CKpan均陽(yáng)性，而冷丙酮固定組陽(yáng)性強(qiáng)度更高。

2.2 一抗?jié)舛鹊谋容^本實(shí)驗(yàn)選用術(shù)中快速送檢的不同組織進(jìn)行一抗?jié)舛忍荻葘?shí)驗(yàn)：乳腺硬化性腺病(p63，1 ∶150～1 ∶300)，乳腺纖維腺瘤(Calponin，1 ∶100～1 ∶400)和低分化癌(CKpan，1 ∶50～1 ∶400)。結(jié)果表明：濃度較高組信號(hào)強(qiáng)度更有利于判讀(圖2)，但需注意觀察組織內(nèi)陰性區(qū)域是否明確，避免一抗?jié)舛冗^(guò)高導(dǎo)致的假陽(yáng)性。

2.3 快速免疫組化和石蠟切片免疫組化分析使用優(yōu)化的術(shù)中快速免疫組化染色技術(shù)，對(duì)新鮮冷凍切片進(jìn)行p63、Calponin和CKpan染色，結(jié)果表明：p63、Calponin對(duì)肌上皮的標(biāo)記和CKpan對(duì)低分化癌的標(biāo)記均定位較明確，術(shù)中快速免疫組化和術(shù)后石蠟切片的免疫組化結(jié)果一致。

圖1 A.AAF固定組：乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中p63呈陽(yáng)性，EnVision法;B.丙酮固定組：乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中p63呈陽(yáng)性，EnVision法 圖2 A.冷凍切片：胸膜低分化癌中CKpan(1 ∶50稀釋組)染色，EnVision法;B.冷凍切片：胸膜低分化癌中CKpan(1 ∶400稀釋組)染色，EnVision法

3 討論

3.1 術(shù)中快速免疫組化注意事項(xiàng)(1)固定液的使用：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷丙酮固定的冷凍切片顯色度最強(qiáng)，與冷丙酮滲透力強(qiáng)[4-5]、抗原保護(hù)作用強(qiáng)有關(guān)。另外其與組織溫差較小，滴加到組織上進(jìn)行固定，可以更好的保護(hù)抗原，效果優(yōu)于AAF固定液。丙酮還具有快速揮發(fā)特點(diǎn)，可以快速晾干切片，無(wú)需PBS溶液沖洗可提高一抗的孵育濃度，并節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。(2)免疫組化操作：孵育溫度、抗體濃度、足量的抗體覆蓋是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。由于快速免疫組化抗體孵育時(shí)間僅為5 min(常規(guī)石蠟切片孵育時(shí)間為1～1.5 h)，因此孵育溫度必須盡快達(dá)37 ℃，并在孵育過(guò)程中保證溫度穩(wěn)定，通常將濕盒預(yù)先在37 ℃孵箱中預(yù)熱，并在孵育過(guò)程中輕輕震蕩混勻。一抗?jié)舛刃韪哂诔Ｒ?guī)石蠟切片的一抗?jié)舛龋鶕?jù)檢測(cè)指標(biāo)表達(dá)的不同，快速免疫組化一抗?jié)舛壬踔烈_(dá)到常規(guī)使用濃度的5～10倍。另外，需保證滴加試劑的量完全覆蓋切片的組織為宜，一般需要150～200 μL。因?yàn)榭贵w濃度對(duì)陽(yáng)性強(qiáng)度影響較大，滴加一、二抗試劑前應(yīng)將PBS沖洗液盡量吸干，以避免抗體試劑被稀釋造成染色不佳或不著色。一抗需要選擇適用于冷凍切片的抗體，個(gè)別實(shí)驗(yàn)抗體僅適用于石蠟切片，用于冷凍切片則顯示實(shí)驗(yàn)失敗，實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳固定液及抗體濃度。

3.2 術(shù)中快速免疫組化的優(yōu)缺點(diǎn)分析本組優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法不需要準(zhǔn)備特殊的抗體及其它化學(xué)試劑和設(shè)備，在日常的術(shù)中快速病理診斷過(guò)程中，可以根據(jù)組織來(lái)源并結(jié)合HE形態(tài)，挑選1～2種抗體進(jìn)行快速免疫組化染色，染色耗時(shí)約15 min。個(gè)別脂肪含量高難以切片或要求定點(diǎn)切疑似浸潤(rùn)區(qū)域的組織，可以先與手術(shù)醫(yī)師溝通，告知初步結(jié)果，再行術(shù)中快速免疫組化檢測(cè)。

術(shù)中快速免疫組化染色也存在缺陷[6]：術(shù)中冷凍組織由于未經(jīng)脫水、浸蠟等步驟，各組織成分軟硬程度不一，影響切片完整度；切片過(guò)程中由于緩慢凍結(jié)或者冷凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等原因，易造成組織細(xì)胞內(nèi)外冰晶及核內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致抗原彌散，影響陽(yáng)性定位和后續(xù)判讀；貼片后不能進(jìn)行烤片，組織和玻片之間貼合僅靠溫差作用和部分電荷作用，組織切片在后續(xù)15 min的持續(xù)浸泡、沖洗過(guò)程中也容易造成組織脫片、彌散等現(xiàn)象，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要克服以上難點(diǎn)。