RASSF7表達與乳腺癌上皮-間質轉化的關系

韓艷春，荊麗麗，石佳寧，朱昊翔，李宗睿，尚丹丹，王 希

近年乳腺癌已成為我國女性發病位居首位的惡性腫瘤，部分患者常因發生浸潤和轉移而死亡，深入了解乳腺癌的轉移機制，才有可能實現乳腺癌的真正治愈[1]。已有研究表明，上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在上皮性腫瘤細胞的侵襲、轉移過程中發揮關鍵作用。因此，研究EMT發生過程的關鍵因子，探討EMT發生機制對于乳腺癌侵襲和轉移的防治具有重要意義。RASSF7是Ras相關結構域家族(ras-association domain family, RASSF)的重要成員之一，與調節細胞死亡和增殖等重要的生物學進程有關，在一些腫瘤組織中呈高表達，并可能促進腫瘤的形成。在缺氧誘導乳腺癌MCF-7細胞mRNA表達譜中研究發現存在RASSF7基因高表達[2]。然而，關于RASSF7在乳腺癌中的表達及其生物學功能研究較少。因此，本實驗初步探討RASSF7在乳腺癌中的表達及作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015～2017年濱州醫學院煙臺附屬醫院病理科存檔的80對乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織標本。所有患者均為女性，均行手術切除術，術前未行放、化療等治療；組織學分級：Ⅰ級30例，Ⅱ級35例，Ⅲ級15例；TNM分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期40例，Ⅲ期11例。無腋窩淋巴結轉移者39例；發生同側腋窩淋巴結轉移者41例。8對新鮮乳腺癌及癌旁正常乳腺組織標本手術切除后立即存放于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 試劑乳腺癌MDA-MB-231細胞系購于上海細胞庫。細胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中培養，置于37 ℃、5%CO2培養箱中傳代培養。取對數生長期乳腺癌細胞待貼壁后分為正常氧對照組、缺氧組(加入終濃度為200 μmol/L CoCl2)培養48 h。

兔抗人RASSF7、HIF-1α抗體購于武漢三鷹生物公司；兔抗人E-cadherin、vimentin、N-cadherin抗體購于北京博奧森生物公司；鼠抗人單克隆GAPDH抗體購于北京中杉金橋公司；ECL發光試劑購于Thermo公司；免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒均購于北京中杉金橋生物公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 乳腺癌及癌旁正常乳腺組織蠟塊標本均制成4 μm厚切片，免疫組化染色采用EnVision法。一抗包括RASSF7(稀釋度1 ∶200)、HIF-1α(稀釋度1 ∶300)、E-cadherin(稀釋度1 ∶300)、vimentin(稀釋度1 ∶300)、N-cadherin(稀釋度1 ∶300)，4 ℃孵育過夜。用已知陽性染色的乳腺癌組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

結果判定：RASSF7陽性主要定位于細胞質，HIF-1α陽性主要定位于細胞核，少量定位于細胞質。按染色細胞比例劃分為五個等級：無陽性細胞為0分，陽性細胞數占1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；按染色強弱則劃分為四個等級：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色或棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項得分結果相乘得分≥2定為RASSF7和HIF-1α陽性。E-cadherin陽性定位于細胞膜，>50%的細胞染為棕黃色顆粒為陽性；N-cadherin陽性定位于細胞膜和(或)細胞質，>10%的細胞染為棕黃色顆粒為陽性；vimentin陽性主要定位于細胞質，>10%的細胞染為棕黃色顆粒為陽性。

1.3.2Western blot法 于-80 ℃超低溫冰箱中備用的乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中加入RIPA裂解液，進行組織蛋白提取，蛋白濃度測定采用BCA法。上樣總蛋白為60 μg，于10%的SDS-PAGE中電泳，電泳結束后將凝膠中的蛋白質轉移至PVDF膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，分別用一抗RASSF7、HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin(抗體終濃度均為1 ∶500)進行4 ℃孵育過夜。次日，用以辣根過氧化物酶標記的相應二抗(稀釋度1 ∶1 500)室溫孵育1.5 h，用ECL發光并拍照。以GAPDH(稀釋度1 ∶1 500)作為內參對照。

1.4 統計學分析采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析，采用Chi-Square檢驗分析RASSF7表達與乳腺癌臨床病理特征的關系，用Pearson相關檢驗分析RASSF7表達與HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達的相關性，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌和癌旁正常乳腺組織中RASSF7的表達免疫組化結果顯示，乳腺癌組織中RASSF7表達主要定位于細胞質(圖1)。乳腺癌組織中RASSF7的陽性率為70.0%(56/80)，明顯高于癌旁正常乳腺組織(27.5%，22/80)，差異有顯著性(P<0.05)。Western blot法結果亦證實，乳腺癌組織中RASSF7蛋白表達高于癌旁正常乳腺組織(圖2)。

圖1 A.乳腺癌中RASSF7呈陽性，EnVision法；B.癌旁正常乳腺組織中RASSF7呈陰性，EnVision法

圖2 Western blot法檢測RASSF7在乳腺癌和癌旁正常乳腺組織中的表達：T.乳腺癌組織；N.癌旁正常乳腺組織

2.2 RASSF7表達與乳腺癌臨床病理特征的關系有淋巴結轉移的乳腺癌組織中RASSF7陽性率明顯高于無淋巴結轉移者(P=0.002)，TNM高分期的乳腺癌組織中RASFF7陽性率明顯高于TNM低分期者(P=0.027)。RASSF7表達與乳腺癌患者年齡、腫塊直徑、腫瘤組織學分級無相關性(P>0.05，表1)。

2.3 不同氧環境下，HIF-1α、RASSF7及EMT標志蛋白表達水平變化分別比較常氧和低氧條件下培養48 h后，MDA-MB-231細胞中EMT標志蛋白表達水平變化。Western blot法檢測結果證實，低氧環境下，MDA-MB-231細胞中上皮標志蛋白E-cadherin表達顯著降低，間質相關蛋白N-cadherin和vimentin表達顯著上升，HIF-1α和RASSF7表達均顯著上調(圖3)。

2.4 乳腺癌組織中RASSF7與HIF-1α、EMT標志蛋白表達之間的關系Pearson相關檢驗顯示，乳腺癌組織中RASSF7與HIF-1α表達呈正相關(r=0.245，P=0.029)，RASSF7與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.33，P=0.003)，與vimentin(r=0.237，P=0.034)和N-cadherin(r=0.301，P=0.007)表達呈正相關(表2)。

表1 RASSF7表達與乳腺癌臨床病理特征的關系[n(%)]

圖3 低氧條件下MDA-MB-231細胞中HIF-1α、RASSF7及EMT標志蛋白表達變化

表2 乳腺癌中RASSF7表達與HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達的關系[n(%)]

3 討論

近來研究結果表明，乳腺癌細胞的EMT是其發生侵襲、轉移的主要原因。EMT是具有極性的上皮細胞與基膜作用后上皮細胞極性消失，獲得間質細胞表型的過程[3-4]。通過EMT過程，乳腺癌細胞能夠獲得更強的侵襲能力，穿過細胞外基質和血管基膜從而進入循環系統，進而形成遠處轉移灶，這是乳腺癌轉移的關鍵步驟。但目前關于乳腺癌EMT的機制尚不明確，需深入探究。

HIF-1α是腫瘤細胞缺氧的重要標志物之一，已有文獻報道調控細胞內HIF-1α的表達水平可影響其EMT的發生。乳腺癌細胞處于缺氧環境下，HIF-1α表達增加，通過一系列信號通路介導下調E-cadherin的表達，使乳腺癌細胞間連接變疏松，向周圍組織侵襲性生長，導致遠處器官轉移[5]。本組實驗結果證實，低氧環境下，MDA-MB-231細胞中上皮標志蛋白E-cadherin表達顯著降低，間質相關蛋白N-cadherin和vimentin表達顯著上升。以上結果提示低氧環境可能與乳腺癌的EMT表型改變有關。

現有實驗已證實低氧環境下MDA-MB-231細胞發生EMT表型改變，后續進一步探討低氧誘導乳腺癌EMT的可能機制。相關研究結果表明RASSF7與調控細胞死亡和增殖等重要生物學進程有關。有報道指出RASSF7在胰腺癌、子宮內膜癌、卵巢透明細胞癌中的表達水平上調，且在腫瘤組織中的表達比正常組織高近百倍，認為RASSF7可能促進癌癥的形成[6]。本組實驗結果表明，RASSF7在乳腺癌組織中呈高表達。最近有研究表明，在低氧條件下人類細胞系中RASSF7蛋白表達上調[7]。本組實驗結果表明，在乳腺癌組織中RASSF7與HIF-1α表達呈正相關，且在低氧環境下MDA-MB-231細胞中HIF-1α和RASSF7表達均顯著上調。提示HIF-1α和RASSF7可能與低氧誘導乳腺癌EMT有關。

Wang等[8]報道DSC1與RASSF7結合并通過RAS/MEK/ERK信號通路調節胚胎腦中的星型膠質細胞形成。Zhang等[9]報道RASSF7通過激活MEK1/2-ERK1/2信號通路促進肝細胞癌細胞增殖。ERK等信號通路通過調節其下游轉錄因子活性而抑制E-cadherin的表達，進而促進EMT的發生。Zheng等[10]發現轉染RASSF7質粒后可以明顯提高Hippo通路轉錄子TEAD的轉錄活性促進非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲。本組實驗結果發現，低氧環境下乳腺癌細胞中RASSF7表達明顯增加，vimentin和N-cadherin呈高表達，E-cadherin呈低表達。且乳腺癌組織中RASSF7與E-cadherin表達呈負相關，與N-cadherin和vimentin表達呈正相關，其表達與乳腺癌淋巴結轉移和TNM分期呈正相關。以上結果提示缺氧誘導RASSF7表達增加，RASSF7與乳腺癌的EMT表型有關，RASSF7可能通過下調E-cadherin，上調vimentin和N-cadherin介導EMT的發生，從而促進乳腺癌的侵襲、轉移。而RASSF7與乳腺癌EMT具體的關聯和機制如何則有待深入探究。RASSF7在乳腺癌發生、發展中的作用及機制，可為乳腺癌的防治和分子靶向治療提供新靶點和思路。