白鮮堿通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞的作用

廖壯文 梁采宇 陳燦偉 楊進(jìn)順 黃帥

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科（廣州510260）

前列腺癌（PCa）是上皮性惡性腫瘤的一種，是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］。前列腺癌之所以危害患者生命，主要是由于腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的一系列病理性破壞［2］。其中骨轉(zhuǎn)移是晚期前列腺癌發(fā)病率最高的并發(fā)癥，且一旦癌細(xì)胞擴(kuò)散到骨骼，它們會(huì)顯著破壞正常的骨重建，導(dǎo)致骨折、神經(jīng)壓迫、疼痛和高鈣血癥［3］。晚期前列腺癌因淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移等各種因素，導(dǎo)致治療效果差［4-5］。目前，在臨床治療上，能有效治療前列腺癌的方案很少，尤其是發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后很差［6-7］。但對(duì)于還沒(méi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌，采取雄激素去除治療可獲得較好的療效［8-9］。所以，要治療前列腺癌、提高患者生存時(shí)間以及改善預(yù)后最關(guān)鍵的一步在于如何阻止或延遲患者前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

既往研究表明，前列腺癌為上皮性腫瘤的一種，其發(fā)生惡性腫瘤轉(zhuǎn)移主要是通過(guò)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)性細(xì)胞［10］，使細(xì)胞極性喪失，失去細(xì)胞間的緊密連接，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力，這個(gè)過(guò)程醫(yī)學(xué)上稱(chēng)為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［11-12］。臨床上大部分前列腺癌患者經(jīng)過(guò)常規(guī)技術(shù)療法后［13］，可發(fā)現(xiàn)殘余的前列細(xì)胞癌細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的EMT 表現(xiàn)［14］。因此，猜測(cè)EMT 對(duì)前列腺癌的轉(zhuǎn)移可能起著重要作用，抑制EMT 過(guò)程將大大增加前列腺癌的治療效果。

白鮮堿（Dictamnine）是一種天然生物堿，可從白鮮根中提取提純出來(lái)［15］。根據(jù)現(xiàn)有的研究實(shí)驗(yàn)表明，白鮮堿對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有著抑制細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。但白鮮堿能否抑制前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和抑制EMT 及機(jī)制還不清楚。因此本次研究探究白鮮堿對(duì)前列腺癌細(xì)胞是否有著同樣的作用。

本次研究中，通過(guò)使用白鮮堿以及聯(lián)合使用Wnt 通道激活劑（LiCl）分別作用于前列腺癌細(xì)胞，分析前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力的改變，從而探究出白鮮堿能否抑制前列腺癌EMT過(guò)程及其機(jī)制，為治療前列腺癌提供新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料人前列腺癌PC-3 細(xì)胞購(gòu)于ATCC（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，美國(guó)），培養(yǎng)基采用型號(hào)RPMI-1640（加入1 × 105U/L 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素和10%胎牛血清）。培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為37 ℃，5%CO2。將PC-3 細(xì)胞接種于培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)商爝M(jìn)行一次換液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 MTS 檢測(cè)細(xì)胞增殖使用0.25%胰蛋白酶消化PC-3 細(xì)胞，重懸后接種于培養(yǎng)板（96 孔，每孔100 μL，細(xì)胞濃度3×104個(gè)/mL）。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的白鮮堿作為實(shí)驗(yàn)組（0、50、100、200、400、800 μmol/L），并建立DMSO 對(duì)照組，每一組設(shè)定8 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后，測(cè)定各組細(xì)胞增殖情況。并得出白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）。然后通過(guò)MTS 檢測(cè)半抑制濃度白鮮堿處理PC-3 細(xì)胞的增殖率，分別在培養(yǎng)0、1、2、3 d時(shí)，于每孔加入10 μL 的MTS 試劑，在37 ℃恒溫箱中孵育3 h，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光值A(chǔ)（490 nm），觀(guān)察白鮮堿在不同的處理時(shí)間對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響。

1.3 白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞形態(tài)變化影響取PC-3細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)加入不同濃度的白鮮堿，實(shí)驗(yàn)組（100、200 μmol/L）與對(duì)照組（0 μmol/L），繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出，分別于顯微鏡下觀(guān)察各組PC-3 細(xì)胞形態(tài)。

1.4 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3 細(xì)胞進(jìn)行遷移試驗(yàn)。在Transwell 上室加入200 μL 含2 × 104個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液（含0.2% FBS），下室分別加入600 μL 培養(yǎng)基（含10% FBS），其中分別加入終濃度為0、100 和200 μmol/L 的白鮮堿。配置PBS 溶液并進(jìn)行預(yù)冷用以洗滌。待細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，因小室上室存在殘余未穿過(guò)細(xì)胞，需使用PBS 洗滌3 次并用棉簽小心謹(jǐn)慎地去除。4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，使用結(jié)晶紫染色20 min。染色后再次PBS 洗滌，置于顯微鏡觀(guān)察并計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組的平均值。

1.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲提前使用Matrigel基底膠包被Transwell 上室后進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，后續(xù)步驟同上。

1.6 PCRPCR 技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)錄mRNA水平，首先提取總mRNA（使用RNA 分離試劑盒（Qiagen，USA），通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄從總mRNA 中提取信使RNA（mRNA）和miRNA，該過(guò)程使用cDNA 合成試劑盒（RFS，美國(guó)）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用iQ SYBR Green（BIO-RAD，USA）在CFX96 系統(tǒng)上擴(kuò)增和定量互補(bǔ)DNA（cDNA）。Real-time PCR 按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。利用RiboBio（中國(guó)廣州）合成并純化U6、E-cadherin、vimentin、Snail、β-catenin 的引物。內(nèi)源性對(duì)照為U6 或甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。最后計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平（使用2-△△Ct法）。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3 細(xì)胞，分成實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組按白鮮堿劑量分成不同的劑量組（100、200 μmol/L 的白鮮堿）。培養(yǎng)24 h 后，加入細(xì)胞裂解液裂解。刮取細(xì)胞、超聲裂解、低溫高速離心后收集上清液。根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞核蛋白，測(cè)蛋白濃度。配置分離膠，分離膠凝固后于上層加入濃縮膠，同時(shí)插入梳子制作膠孔。待膠凝固后于膠孔中加入蛋白樣品，進(jìn)行電泳。電泳完成后轉(zhuǎn)膜。加入50 g/L 脫脂奶粉進(jìn)行搖床封閉90 min。分別加入一抗vimentin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、Snail（1∶1 000）和β-actin 抗體（1∶3 000）置于4 ℃冰箱過(guò)夜后，使用TBST 進(jìn)行洗膜，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶3 000），在室溫下避光孵育2 h。洗膜、熒光顯影。使用Quantity One 軟件掃描并做灰度分析。

1.8 LiCl 和白鮮堿聯(lián)合處理細(xì)胞采用Wnt 通路激活劑LiCl（5 μmol/L）處理細(xì)胞3 h 后，使用上述PCR 技術(shù)檢測(cè)相關(guān)mRNA 水平。隨后取出部分細(xì)胞樣本，再加入200 μmol/L 白鮮堿作用細(xì)胞24 h。剩余樣本作為對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)24 h。最后利用上述PCR 技術(shù)檢測(cè)相關(guān)mRNA 水平，利用Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0 軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，通過(guò)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)兩兩比較，使用方差分析的方法分析多組間數(shù)據(jù)的比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞增殖的影響將不同濃度的白鮮堿處理PC-3 細(xì)胞48 h 后，隨著白鮮堿濃度的升高，細(xì)胞增殖受到抑制的程度越來(lái)越顯著，且呈劑量依賴(lài)性，其中，PC-3 細(xì)胞增殖的半抑制濃度IC50約為200 μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of Dic at different concentrations on the proliferation of PC-3 cells

2.2 白鮮堿不同時(shí)間處理對(duì)PC-3 細(xì)胞增殖的影響以特定濃度（200 μmol/L）的白鮮堿處理前列腺癌PC-3 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組（無(wú)白鮮堿）。培養(yǎng)24、48、72 h 分別檢測(cè)PC-3 細(xì)胞增殖率。通過(guò)結(jié)果分析，在相同的培養(yǎng)時(shí)間里，白鮮堿組的PC-3 細(xì)胞增殖比對(duì)照組的明顯減少，隨著時(shí)間的推移（48、72 h），兩組間的差異越大，白鮮堿組的PC-3 細(xì)胞增殖受抑制更明顯，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 白鮮堿抑制PC-3 細(xì)胞的遷移能力行Transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn)后，切片染色后置于顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)白鮮堿組的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)明顯比對(duì)照組的少，且高劑量組比低劑量組的遷移細(xì)胞數(shù)更少（P＜0.01）。證明白鮮堿可抑制PC-3 細(xì)胞的遷移能力（圖3）。

圖2 白鮮堿不同時(shí)間處理對(duì)PC-3 細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of Dic at different times on the proliferation of PC-3 cells

圖3 白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of Dic on the migration in PC-3 cells

2.4 白鮮堿抑制PC-3 細(xì)胞的侵襲能力根據(jù)Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果，染色后置于顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)白鮮堿組的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)明顯比對(duì)照組的少，且高劑量組（200 μmol/L）比低劑量組（100 μmol/L）的侵襲細(xì)胞數(shù)更少（P＜0.01）。證明白鮮堿可抑制PC-3 細(xì)胞的侵襲能力（圖4）。

2.5 白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞形態(tài)影響白鮮堿處理PC-3 細(xì)胞后，PC-3 細(xì)胞從棒狀或長(zhǎng)紡錘形的間充質(zhì)群體變化成短紡錘形或圓形的扁平上皮細(xì)胞形態(tài)（圖5）。

2.6 白鮮堿抑制PC-3細(xì)胞EMT的作用為探究白鮮堿抑制PC-3 細(xì)胞EMT 作用，選擇觀(guān)察E-cadherin和vimentin 這兩種EMT 標(biāo)志物的表達(dá)。PCR 及Western blot 法檢測(cè)結(jié)果表明，100、200 μmol/L 白鮮堿組的E-cadherin mRNA 及蛋白表達(dá)水平均比對(duì)照組水平高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而高劑量組（200 μmol/L）的vimentin 的mRNA 及蛋白表達(dá)明顯受抑制，與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖6）。可據(jù)此推測(cè)，白鮮堿具有逆轉(zhuǎn)前列腺癌細(xì)胞EMT 作用。

圖4 白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of Dic on the invasion in PC-3 cells

圖5 白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞形態(tài)影響Fig.5 Influence of Dic on the morphology of PC-3 cells

2.7 白鮮堿抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑與對(duì)照組比較，100、200 μmol/L 白鮮堿組β-catenin 和Snail 的mRNA及蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，圖6）。與對(duì)照組比較，Wnt激活劑LiCl組β-catenin和Snail 的mRNA 及蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05，圖7）。

與200 μmol/L 白鮮堿組比較，Wnt 激活劑LiCl與白鮮堿聯(lián)合應(yīng)用會(huì)促進(jìn)Snail 的mRNA 水平及蛋白的表達(dá)，抑制E-cadherin 的mRNA 及蛋白的表達(dá)（P＜0.01，圖8）。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是引起大多數(shù)腫瘤患者死亡的原因之一。腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、抗凋亡和降解的能力有賴(lài)于EMT 過(guò)程［16-17］。EMT 是上皮細(xì)胞惡性腫瘤獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞骨架會(huì)轉(zhuǎn)化為以波形蛋白（vimentin）為主，在此過(guò)程中細(xì)胞黏附分子（如E-鈣黏蛋白）會(huì)明顯減少［18］。E-cadherin 可以阻止細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，其表達(dá)的下降是EMT 發(fā)生的關(guān)鍵因素［19］。

圖6 白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞vimentin、E-cadherin、Snail 和β-catenin mRNA 及蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of Dic on the mRNA and protein expression of vimentin，E-cadherin，snail and β-Catenin in PC-3 cells

圖7 100、200 μmol/L 白鮮堿組對(duì)PC-3 細(xì)胞Snail 和β-catenin mRNA 及蛋白表達(dá)的影響Fig.7 The effects of 100 and 200 μmol/L Dic groups on the mRNA and protein expression of snail and β-Catenin in PC-3 cells

圖8 白鮮堿與LiCl 聯(lián)合作用對(duì)PC-3 細(xì)胞Snail 和E-cadherin mRNA 及蛋白表達(dá)的影響Fig.8 The combined effects of Dic and LiCl on the mRNA and protein expression of snail and E-cadherin in PC-3 cells

白鮮堿作為一種天然生物堿，其在抗腫瘤、抗炎等方面表現(xiàn)出巨大的潛力［20］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用白鮮堿可明顯抑制vimentin 的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Ecadherin 的合成。通過(guò)模擬遷移及侵襲試驗(yàn)可見(jiàn)，使用白鮮堿的實(shí)驗(yàn)組其遷移、侵襲的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少。且使用白鮮堿的濃度越高，對(duì)PC-3 細(xì)胞遷移侵襲的能力抑制得更明顯。可推斷出，白鮮堿通過(guò)影響E-cadherin 和vimentin 的表達(dá)水平，從而抑制EMT 過(guò)程，導(dǎo)致人前列腺癌細(xì)胞的增殖及遷移受抑制。

本次研究中發(fā)現(xiàn)，在相同的處理時(shí)間（1、2、3 d），可發(fā)現(xiàn)各時(shí)間段的白鮮堿組與對(duì)照組相比，前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖明顯受抑制，且白鮮堿的濃度越大，抑制前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖的作用越強(qiáng)，而且受抑制的程度與白鮮堿濃度呈正相關(guān)性。而對(duì)于同一濃度的白鮮堿組，增加其培養(yǎng)的時(shí)間，可發(fā)現(xiàn)PC-3 細(xì)胞增殖的細(xì)胞數(shù)上升不明顯甚至下降，說(shuō)明其受抑制的程度與處理時(shí)間呈正相關(guān)性。

通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)使用白鮮堿處理的PC-3 細(xì)胞發(fā)生了從棒狀或長(zhǎng)紡錘形的間充質(zhì)群體變化成短紡錘形或圓形的扁平上皮細(xì)胞形態(tài)。隨著白鮮堿濃度的增加，其遷移能力及侵襲能力明顯下降。因白鮮堿可改變細(xì)胞形態(tài)變化，且其改變與EMT 的形態(tài)改變相反，推斷出白鮮堿可能可以抑制或逆轉(zhuǎn)EMT 過(guò)程，從而抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。

為探究在前列腺癌細(xì)胞中EMT 中信號(hào)通路的變化及分子調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)，最主要的信號(hào)通路為Wnt 信號(hào)通路［21-22］，Wnt 通路的發(fā)現(xiàn)為研究EMT 分子變化機(jī)制提供了新的方向［23］。對(duì)于Wnt 通路的研究表明，β-catenin 是其中最關(guān)鍵的因素之一，該蛋白可與自身免疫細(xì)胞（如T 細(xì)胞）產(chǎn)生的因子相結(jié)合，從而激活Snail 蛋白的合成。而Snail 可在E-cadherin基因上游與之結(jié)合，從而抑制啟動(dòng)區(qū)域的激活，最終抑制E-cadherin 表達(dá)，促進(jìn)EMT 的發(fā)生。本研究分別檢測(cè)出β-catenin 和Snail 蛋白的表達(dá)來(lái)探究白鮮堿抑制PC-3 細(xì)胞EMT 的分子機(jī)制。結(jié)果表明，對(duì)照組PC-3 細(xì)胞的β-catenin 和Snail mRNA 及蛋白表達(dá)較高，而白鮮堿組的β-catenin和Snail mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯下降，所以，可推斷出白鮮堿可能通過(guò)抑制β-catenin 和Snail蛋白的表達(dá)從而控制Wnt 途徑，進(jìn)而抑制EMT 的發(fā)生，達(dá)到抑制前列腺癌PC-3 細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。

為更進(jìn)一步研究白鮮堿對(duì)EMT 抑制作用的機(jī)制，采取Wnt 通路激活劑LiCl，研究LiCl 對(duì)PC-3 細(xì)胞Snail 及E-cadherin 影響，以及聯(lián)合使用LiCl 與白鮮堿對(duì)PC-3 細(xì)胞Snail 及E-cadherin 影響。結(jié)果表明，通道激活劑LiCl 對(duì)Snail 蛋白的表達(dá)有著促進(jìn)作用，從而可抑制E-cadherin 的表達(dá)。當(dāng)使用白鮮堿與Wnt 通路激活劑LiCl 聯(lián)合處理前列腺PC-3 細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)LiCl 能夠拮抗白鮮堿誘導(dǎo)的Snail 蛋白的表達(dá)下調(diào)的能力，甚至可促進(jìn)Snail 的表達(dá)，導(dǎo)致E-cadherin 表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)白鮮堿可抑制人前列腺PC-3 細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。其中機(jī)制可能通過(guò)抑制前列腺癌細(xì)胞的EMT，而抑制EMT 的途徑可能是通過(guò)阻止Wnt/β-catenin/Snail 信號(hào)通路。因此，利用白鮮堿這一特性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究，為臨床治療前列腺癌及預(yù)防其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移開(kāi)發(fā)出新的藥物或新的治療方案。