LncRNA HOTAIR通過調控miR-30d影響鼻咽癌細胞的侵襲和遷移

陳曦 朱悅瑩 施典羽 顏帥 湯國棟 鄒宇

1廣東省婦幼保健院耳鼻咽喉科（廣州511400）；2深圳市龍華區人民醫院耳鼻咽喉科（廣東深圳518109）

鼻咽癌是我國南方地區尤其是廣東省高發的腫瘤之一，占頭頸部腫瘤發病率首位。鼻咽癌的重要臨床特點是易發生局部和遠處轉移，頸部淋巴結轉移率高達70%以上［1-2］，有約30% ～40%的鼻咽癌患者由于轉移和復發未能長期生存。HOTAIR是被發現的第一個有反式調節轉錄作用并影響其他染色體基因轉錄的LncRNA［3］，HOTAIR的高表達與包括結腸癌在內的多個惡性腫瘤的復發轉移及不良預后密切相關［4-6］。最新研究表明HOTAIR 在鼻咽癌中表達水平升高，與鼻咽癌的T 分期和N 分期密切相關，提示HOTAIR 的高表達可能與鼻咽癌的增殖轉移關系密切［7］，然而目前有關HOTAIR 在鼻咽癌發生發展中的研究較少，相關機制尚未明確。前期通過軟件分析發現HOTAIR 在miR-30 家族中有多個調控位點。研究顯示miR-30 家族成員在鼻咽癌組織中較癌旁正常組織表達下降［8-9］，根據生物信息學分析，本研究選擇miR-30d 作為HOTAIR 的調控目標，研究兩者的作用可能對鼻咽癌細胞侵襲遷移及相關調節蛋白帶來的影響，以期進一步闡明該疾病的轉移機制，有望建立更有效的靶向治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料鼻咽癌CNE-2 細胞購自廣州索友百生物科技有限公司，HOTAIR siRNA、miR-30d mimics和miR-30d inhibitor 及相應對照組由上海吉瑪生物制藥有限公司合成，cDNA 合成及定量PCR 試劑盒購自Takara 公司，Anti-Vimentin（3932S）和Anti-E-cadherin（14472S）抗體購自Cell signal technology公司，Anti-GRP78（H-129）抗體購自Santa cruz 公司，熒光素酶檢測試劑盒（E1910）購自Promega 公司，熒光素酶報告載體由上海欣基生物科技有限公司構建，Lipofectamine3000 轉染試劑購自Invitrogen，引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。HOTAIR 上游5′-CCACAUGAACGCCCAGAGAUUTT-3′，下游5′-GAACGGGAGUACAGAGAGAUU-3′；miR-30d 上游5′-GGGTGTAAACATCCCCGACT-3′，下游5′-CGTATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；GAPDH 上游5′-TGGCACCCAGCACAATGA A-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCG CCTAGAAGCA-3′；U6 上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCRTrizol 法抽提細胞總RNA，純度檢測合格后反轉錄成cDNA，采用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進行定量PCR 檢測，PCR 反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃34 s，40 個循 環；HOTAIR 和miR-30d 分 別 以GAPDH 和U6 作為內參。

1.2.2 Transwell 法檢測CNE-2 細胞侵襲和遷移數目用不含血清的細胞培養液將各研究組細胞配制成濃度為1 × 106/mL 的單細胞懸浮液，將100 μL 的細胞懸浮液添加到Transwell 小室的上室中，在下室中添加含有10%胎牛血清的細胞培養液，37 ℃孵育24 h，用棉簽將沒有穿膜的細胞擦掉，結晶紫染色后在顯微鏡下隨機選取5 個視野分析細胞遷移數目；侵襲實驗步驟同上，在侵襲實驗前用基質膠將小室濕化。

1.2.3 Western blot 檢測蛋白表達提取轉染48 h后的各組細胞總蛋白并進行定量，按每1 μL 樣品加入0.25 μL 上樣緩沖液的比例混合，沸水加熱變性5 min，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后遷移至硝酸纖維素膜，加入5 g脫脂奶粉與100 mL TBST配成的封閉緩沖液，置于振蕩培養箱中26 ℃封閉2 h，洗膜后分別加入E-cadherin，vimentin（1∶500）及GRP78 一抗（1∶250），4 ℃孵育過夜；再分別用辣根過氧化酶標IgG 抗體（1∶1 500）二抗雜交，GAPDH 作為內參，比較目的條帶灰度值，實驗重復3 次。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測將HOTAIR 結合序列突變，分別構建突變型（pmiRGLO-HOTAIRMUT）和野生型熒光素酶報告載體（pmiRGLO-HOTAIR-WT）。將HOTAIR-MUT 和HOTAIR-WT 與miR-30dmimics 和mimics control 共轉染至CNE-2 細胞中，培養48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.2.5 細胞轉染與分組按轉染試劑說明書要求將HOTAIR siRNA 和siRNA control 轉染至CNE-2 細胞中，把轉染HOTAIR siRNA 和siRNA control 后的細胞設置為si-HOTAIR 組和si-con 組，未轉染的細胞設為control 組。RT-qPCR 檢測轉染效率；設置轉染miR-30d mimics 和mimics control 后 的CNE-2 細胞為miR-30d 組和miR-NC 組，RT-qPCR 檢測兩組細胞miR-30d 的表達；同時用RT-qPCR 檢測control、si-con、si-HOTAIR、vector（轉染陰性對照載體pcDNA3.1）和HOTAIR（轉染pcDNA3.1-HOTAIR）各組細胞中miR-30d 的表達，U6 作為內參。在CNE-2 細胞中共轉染HOTAIR siRNA 和miR-30d inhibitor，命名為si-HOTAIR+anti-miR-30d 組；共轉染HOTAIR siRNA 和inhibitor control，命名為si-HOTAIR+anti-NC 組，用RT-qPCR、Western blot 以及Transwell 法檢測CNE-2 細胞中相關基因蛋白的表達及侵襲和遷移細胞數目。

1.3 統計學方法應用SPSS 16.0 進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示，兩組數據間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，組間比較用SNK 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 下調HOTAIR 抑制CNE-2 細胞侵襲、遷移數目及GRP78 和EMT 相關蛋白表達RT-qPCR 檢測HOTAIR 轉染效率，CNE-2 細胞中si-HOTAIR 組HOTAIR基因表達水平明顯低于si-con組（P＜0.05），見圖1A。與si-con 組相比，si-HOTAIR 組CNE-2 細胞的侵襲和遷移數目明顯降低，同時細胞中上皮細胞分子標志物E-cadherin 水平升高，間質細胞分子標志物vimentin 水平降低，GRP78 表達下降（P＜0.05），見圖1B、C。

圖1 下調HOTAIR 后CNE-2 細胞侵襲、遷移數目及相關蛋白表達變化Fig.1 The change of the invasion and migration number of CNE-2 cells and the expression of related proteins after down-regulation of HOTAIR

2.2 HOTAIR 靶向負調控miR-30d 的表達根據RNA22 version 2.0 預測 的HOTAIR 和miR-30d 靶 向結合位點（圖2A），轉染miR-30d mimics 后，細胞中的miR-30d 表達升高（圖2B），HOTAIR-WT 和miR-30d mimics 共轉染后細胞熒光素酶活性降低（圖2C），在CNE-2 細胞中si-HOTAIR 組miR-30d 的表達水平明顯高于si-con 組；HOTAIR 組miR-30d 的表達水平明顯低于vector 組（圖2D）；結果顯示HOTAIR 可以負向調控miR-30d 的表達。

圖2 HOTAIR 靶向負調控miR-30d 的表達Fig.2 HOTAIR negatively regulates the expression of miR-30d specifically

2.3 下調miR-30d逆轉敲減HOTAIR對CNE-2細胞侵襲、遷移數目及EMT相關蛋白的影響CNE-2細胞中si-HOTAIR＋anti-miR-30d 組miR-30d 的表達水平明顯低于si-HOTAIR+anti-NC 組（P＜0.05），說明轉染miR-30d inhibitor 后明顯抑制miR-30d的表達（圖3A）。與si-HOTAIR+anti-NC 組相比，si-HOTAIR+anti-miR-30d 組在CNE-2 細胞中的侵襲和遷移數目增加（圖3B），免疫印跡結果顯示vimentin 和GRP78 表達增加，E-cadherin 表達下降（圖3C）。

3 討論

鼻咽癌的侵襲轉移涉及多個基因和信號通路的改變，HOTAIR 在許多腫瘤的發生進展中起重要作用，介導了包括肺癌、胃癌等多種癌癥的發生和轉移［10-11］。本實驗發現下調HOTAIR 表達后，鼻咽癌細胞的侵襲、遷移能力降低，這與其它腫瘤的研究結果一致，提示HOTAIR 可能是腫瘤侵襲促進因子。有研究顯示其表達與鼻咽癌放療效果不佳呈正相關，可作為評估腫瘤進展和患者生存率的獨立預后指標［12］。一些異常表達的LncRNA與相關miRNA 的相互作用被證實是鼻咽癌發生和轉移的重要分子生物學基礎［13-14］，miR-30d 是miR-30家族的六個成員之一，在多個類型的人類上皮腫瘤研究發現miR-30d 表達的調節異常［15-16］，證實miR-30d 通過調控GNA13 在抑制結直腸癌的增殖和侵襲中發揮了重要的作用［17］。事實上大部分LncRNA 都可以作為競爭性內源RNA 發揮海綿效應抑制miRNA，并進一步調節下游蛋白表達［18］。

腫瘤細胞遷移的關鍵步驟是細胞的遷移運動，部分上皮細胞向間質細胞轉化（EMT），細胞間緊密連接被破壞，黏附減弱，運動増強，使細胞獲得了游走的能力。GRP78 是一類調節腫瘤細胞凋亡與血管生成的蛋白，在鼻咽癌細胞中沉默GRP78，可以促進細胞凋亡，使細胞對去離子輻射和順鉑的抵抗力下降［19］。FU 等［20］在鼻咽癌細胞和標本中發現HOTAIR 可以通過靶向GRP78 介導的VEGFA 和Ang2 表達上調來促進腫瘤血管的生成，這可能是促進鼻咽癌侵襲轉移的機制之一。綜上所述，本研究表明HOTAIR 可以通過miR-30d 調節GRP78 和EMT 相關蛋白的表達，并有利于促進鼻咽癌細胞的侵襲與遷移。下一步將深入研究miR-30d 與GRP78 和EMT 相關蛋白之間的關系進一步闡明其具體調控機制。

圖3 miR-30d inhibitor 逆轉敲減HOTAIR 對CNE-2 細胞侵襲、遷移及相關蛋白表達的影響Fig.3 The miR-30d inhibitorreversedtheeffectsof HOTAIR knock-down oninvasion，migration abilities of CNE-2 cells and the expression of related protein