IL-6/STAT3通路在肺結核患者巨噬細胞免疫中的作用機制

魯進 尹伶 黃漢平

1武漢科技大學醫學院（武漢430081）；2鄂州市第三醫院感染科（湖北鄂州436000）；3武漢市金銀潭醫院結核科（武漢430023）

肺結核是一種由結核分枝桿菌感染肺部引起的慢性感染性疾病，患者會出現咳嗽、咳血、體質量下降等癥狀，治療不及時會危及生命［1］。調查顯示，全世界人口中感染過結核分枝桿菌的人占1/3，其中大部分感染者沒有特異性的臨床癥狀，約5% ～10%的感染者不經過治療會發展為肺結核［2-3］。WHO 相關數據表明，全球每年結核病患者人數達800 ～1 000 萬例，死亡人數達300 萬人，死亡率在非復合傳染病中位居第一［4］。巨噬細胞是機體內的免疫效應細胞及免疫調節細胞，能吞噬病原體、分泌細胞因子并活化其他免疫細胞［5］。研究發現，巨噬細胞是結核分枝桿菌在機體內的主要存活地，結核分枝桿菌可通過調控巨噬細胞的功能保證自身存活［6-7］。白細胞介素（interleukin，IL）-6 是在細胞內廣泛存在的炎癥細胞因子，可通過與受體結合將信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化激活，繼而參與細胞內的大量生物應答［8］。另有研究發現，結核分枝桿菌6-kDa 的早期分泌抗原靶點可以通過激活STAT3 刺激巨噬細胞產生IL-6［9］。基于此，本研究將通過檢測IL-6、STAT3 在肺結核患者及巨噬細胞中的表達水平，初步探討其具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取2017年10月至2019年10月在武漢市金銀潭醫院接受治療的肺結核患者92 例（觀察組）作為研究對象，男52 例，女40 例，年齡46 ～74 歲，平均年齡（59.73 ± 5.46）歲，診斷符合中華醫學會結核病學分會制定的《肺結核診斷和治療指南》［10］，排除合并其他免疫缺陷疾病、其他臟器功能受損、惡性腫瘤、其他慢性疾病或近半年有過免疫治療的患者。選取同期健康體檢者95 例（對照組）作為對照，男50 例，女45 例，年齡48 ～74 歲，平均年齡（60.85 ± 5.65）歲。本研究通過本院倫理委員會審核，并所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器人巨噬細胞（貨號：PB-MDM-002F-C）購自澳賽爾斯生物技術（上海）有限公司；結核分枝桿菌（貨號：ZY-10850）購自上海澤葉生物科技有限公司；細胞裂解液（貨號：BB-3207）購自上海貝博-Bestbio；BCA蛋白質定量試劑盒（貨號：PA115-01）購自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清（貨號：FBS500-S）購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM 培養基（貨號：KL-P0032）購自德國merck/sigma 公司；STAT3 抗體、p-STAT3 抗體、核因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65、GAPDH 抗 體（貨 號：ab109085、ab76315、ab16502、ab183559、ab181602）購自abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（貨號：0295G-HRP）購自美國santa 公司；人IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）酶聯免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：HL10458、HL10473、HL10038）購自上海哈靈生物科技有限公司；恒溫培養箱（型號：TY10GI2-2）購自美國Shellab 公司；酶標儀（型號：MODEL550）購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達水平在晨間空腹狀態下抽取兩組受試者外周靜脈血，分為兩份。一份加入裂解液裂解30 min，4 ℃10 000 r/min 離心10 min 獲得總蛋白，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進行10%SDS-PAGE 凝膠電泳，將凝膠中的蛋白質轉移至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉2 h，加入p-STAT3 抗體、STAT3 抗體、p-NF-κB p65抗體、NF-κB p65 抗體、GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜，化學發光法顯色，凝膠成像系統顯影，拍攝圖像并分析條帶灰度，計算目的蛋白相對表達量。

1.4 ELISA 法檢測血清炎癥因子水平取另一份外周靜脈血，4 ℃3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書，采用ELISA 法檢測受試者血清IL-6、IL-10、TNF-α水平，使用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度（optical density，OD）值，配制標準液，根據標準液吸光度結果繪制標準曲線，計算IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.5 細胞培養與分組將巨噬細胞培養于含有10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。細胞融合至70% ～80%時傳代培養。實驗分為兩組：正常組和感染組。正常組巨噬細胞不做處理，感染組巨噬細胞用結核分枝桿菌感染。

1.6 Western blot法檢測各組巨噬細胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達水平將巨噬細胞以1×105個/mL 的密度接種于培養瓶，按1.2.3 分組處理，培養48 h，收集細胞，細胞裂解液裂解獲得細胞中總蛋白，測定蛋白濃度。電泳、轉膜、封閉2 h，加入p-STAT3 抗體、STAT3 抗體、p-NF-κB p65 抗體、NF-κB p65 抗體、GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，洗膜，顯色、顯影、拍攝圖像、分析條帶灰度，計算目的蛋白相對表達量。

1.7 ELISA 法檢測各組巨噬細胞上清液中炎癥因子水平將巨噬細胞以1 × 105個/mL 的密度接種于24 孔板，按1.2.3 分組處理，培養48 h，離心取上清液，ELISA 法檢測上清液中IL-6、IL-10、TNF-α水平，使用酶標儀測定450 nm 波長處的OD值，計算IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.8 統計學方法數據處理采用SPSS 24.0 統計學軟件。計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用成組t檢驗。當P＜0.05 時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組、觀察組受試者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達水平與對照組相比，觀察組肺結核患者外周血中p-STAT3/STAT3、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 對照組、觀察組受試者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達情況Fig.1 Expression of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood of subjects in control group and observation group

表1 對照組、觀察組受試者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達水平比較Tab.1 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood between control group and observation group±s

表1 對照組、觀察組受試者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達水平比較Tab.1 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood between control group and observation group±s

組別 例數p-STAT3/STAT3p-NF-κB p65/NF-κB p65對照組950.42±0.090.54±0.13觀察組t 值P 值92 0.75±0.11 22.485＜0.001 0.95±0.14 20.761＜0.001

2.2 對照組、觀察組血清炎癥因子水平與對照組相比，觀察組肺結核患者血清中IL-6、IL-10、TNF-α表達水平顯著升高（P＜0.05），見表2。

2.3 正常組、感染組巨噬細胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達水平與正常組相比，感染組巨噬細胞中p-STAT3/STAT3、p-NFκB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 正常組、感染組巨噬細胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達情況Fig.2 Expression of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group

表2 對照組、觀察組受試者血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平比較Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6，IL-10 and TNF-α between the control group and the observation group ±s

表2 對照組、觀察組受試者血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平比較Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6，IL-10 and TNF-α between the control group and the observation group ±s

組別 例數IL-6（ng/mL）IL-10（ng/mL）TNF-α（pg/mL）對照組9533.59±2.56237.03±10.8877.61±6.95觀察組9282.16±4.74366.92±10.64172.35±7.87 t 值P 值87.559＜0.001 82.507＜0.001 87.327＜0.001

2.4 正常組、感染組巨噬細胞上清液中炎癥因子水平與正常組相比，感染組巨噬細胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表達水平顯著升高（P＜0.05），見表4。

3 討論

肺結核的發病與免疫功能有關，免疫功能長期低下的人群更容易并發肺結核，而肺結核的主要免疫機制與細胞免疫有關［11］。肺結核是由結核分枝桿菌感染肺部引發的傳染性疾病，其致死性僅次于艾滋病，結核分枝桿菌感染后，巨噬細胞會分泌大量的細胞因子，將淋巴細胞、單核細胞活化，進而殺滅結核分枝桿菌［12］。流行病學數據顯示，盡管全球1/3 左右的人感染過結核分枝桿菌，其中發展為肺結核的感染者僅占5% ～10%，這種現象也表明患者機體的免疫系統在控制結核分枝桿菌感染方面發揮了重要作用［2］。然而，巨噬細胞作為基礎免疫細胞，在吞噬、滅殺結核分枝桿菌的同時，由于結核分枝桿菌感染后作用于巨噬細胞的一系列機制，導致對結核分枝桿菌殺傷力降低，同時給結核分枝桿菌在人體內的長期存活提供了有利環境［13-14］。為了提高感染結核分枝桿菌后的免疫功能，深入了解肺結核患者巨噬細胞免疫的具體機制具有重要意義。

表3 正常組、感染組巨噬細胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達水平比較Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group ±s

表3 正常組、感染組巨噬細胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達水平比較Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group ±s

組別p-STAT3/STAT3p-NF-κBp65/NF-κBp65正常組0.36±0.070.79±0.07感染組t 值P 值0.82±0.09 9.882＜0.001 0.93±0.08 3.226 0.009

表4 正常組、感染組巨噬細胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表達水平比較Tab.4 Comparison of expression levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in macrophage supernatant of normal group and infection group ±s

表4 正常組、感染組巨噬細胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表達水平比較Tab.4 Comparison of expression levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in macrophage supernatant of normal group and infection group ±s

組別IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）TNF-α（pg/mL）正常組176.02±12.48535.82±20.07245.44±13.55感染組t 值P 值285.69±14.31 14.1480＜0.001 794.56±20.56 22.058＜0.001 374.12±16.79 14.609＜0.001

IL-6 是一種由巨噬細胞及T 淋巴細胞分泌的具有促炎作用的白細胞介素，參與免疫反應，是STAT3 經典的上游激活因子，可以改變STAT3 蛋白質構象，促進STAT3 磷酸化，進而激活NF-κB 信號通路，調控炎癥細胞因子表達［15-16］。IL-10 是常見的抑炎因子，可抑制炎性細胞因子產生及抗原特異性T 細胞的激活［17］。TNF-α是常見的促炎因子，在免疫性肝損傷過程中受到NF-κB 信號通路的調控［18］。HARLING 等［19］研究表明，與健康接觸者相比，結核病患者IL-6、IL-10 表達水平均顯著升高，可能是由致病細胞因子引起的。本研究結果顯示，觀察組肺結核患者外周血中STAT3 磷酸化、NF-κB磷酸化蛋白水平及血清中IL-6、IL-10、TNF-α表達水平均顯著升高，提示肺結核患者外周血中炎癥反應平衡紊亂，促炎、抑炎機制均被激活。

巨噬細胞在肺結核發生發展過程中扮演重要角色。一方面，作為免疫系統中的基礎免疫細胞，在病原菌結核分枝桿菌感染后攻擊、吞噬結核分枝桿菌，或激活細胞免疫應答反應，誘導其他細胞因子釋放及T 淋巴細胞聚集，增強對結核分枝桿菌的攻擊作用［20］。另一方面，結核分枝桿菌被巨噬細胞吞噬后，可誘導泡沫巨噬細胞形成，導致巨噬細胞的表型、功能均發生改變，不僅降低了對結核分枝桿菌的吞噬、殺傷能力，還會抑制抗結核分枝桿菌特異性免疫應答的產生［21］。本研究采用結核分枝桿菌感染巨噬細胞發現，巨噬細胞中STAT3 磷酸化、NF-κB 磷酸化蛋白表達水平及IL-6、TNF-α表達水平均顯著升高，提示巨噬細胞被結核分枝桿菌感染后可能分泌IL-6，促進STAT3 蛋白磷酸化，進而激活NF-κB 蛋白，導致炎癥因子TNF-α水平升高，同時，結核分枝桿菌通過誘導巨噬細胞分泌IL-10 抑制免疫反應，以保證自身存活［22］。

綜上所述，肺結核患者外周血及感染結核分枝桿菌的巨噬細胞上清液中IL-6 表達水平升高，可能通過促進STAT3 蛋白磷酸化激活NF-κB 通路，提高免疫反應。