從浙江選考命題角度解讀“原生質體”的疑難問題

嚴靈劍

摘要 從原生質體獲取、純化、培養、分裂和活性鑒定五個方面，深入解讀了近幾年浙江選考題中涉及原生質體的疑難問題。

關鍵詞 原生質體 教學疑難 生物選考

中圖分類號 G633.91

文獻標志碼 B

原生質體研究的熱潮開始于20世紀80年代早期，并在隨后的幾年中逐步深入。目前，包括園藝植物在內的近400種植物已成功實現原生質體的分離。而且高等植物的原生質體已廣泛的用于細胞融合、攝入外源DNA、細胞器、細菌或病毒顆粒等研究。在浙江省的選考試題中會經常出現原生質體的影子。

1原生質體是否一定要用纖維素酶和果膠酶來獲取

分離原生質體常用的酶有果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶。一般來說，分離葉肉細胞和懸浮細胞的原生質體時只需纖維素酶和果膠酶即可。纖維素酶消化細胞壁的纖維素，果膠酶主要降解中膠層。分離愈傷組織原生質體時，加上半纖維酶來降解細胞壁中的半纖維素，分離效果會更好，酶的用量和酶解時間需適當增加。由此可見，原生質體的取材來源直接決定了所需酶的種類。

[例1]（2016年浙江選考T32）（節選）（1）原生質體的分離：在無菌條件下，取煙草無菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L甘露醇（維持較高滲透壓）的的混合液處理，經過離心純化后獲得原生質體。

分析：這題是從葉片進行處理來獲得原生質體，類似于從葉肉細胞中分離原生質體，所以要加纖維素酶和果膠酶。

參考答案：纖維素酶和果膠酶。

2原生質體為什么要純化及如何純化

細胞酶解后的混合物中，除完整未損傷的原生質體外，還含有許多雜質，如細胞碎片、葉綠體、維管束成分、未被消化的細胞組織和破裂的原生質體。因而必須把這些雜質除掉。清除較大碎屑的方法是使酶解后的混合物穿過一個50～70μm的鎳絲網進行過濾。然后，再利用密度，通過多次離心，取某一界面物或是除去上清液，進一步純化。最后，獲得純凈的原生質體。由此可見，酶解后的混合物經過過濾、離心等純化步驟后，才能獲得想要的原生質體。

[例2]（2016年浙江選考T32）（節選）（1）原生質體的分離：在無菌條件下，取煙草無菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L甘露醇（維持較高滲透壓）的纖維素酶和果膠酶的混合液處理，經過后獲得原生質體。

分析：在獲取原生質體的過程中會混有雜質，可以通過過濾初步純化，再通過離心進一步純化。

參考答案：離心純化。

3原生質體培養過程中何時降低滲透壓在原生質體還沒有再生出一個堅韌的細胞壁之前，必須有培養基滲透壓的保護。培養基中的滲透壓一般是用0.5～0.6mol/L甘露醇或山梨醇調節的。培養開始后7～10d，大部分有活力的原生質體已經再生出細胞壁并進行了幾次分裂，此后通過定期加入幾滴不含滲壓劑或滲壓劑水平很低的新鮮培養基，可使培養基的滲透壓逐漸下降（若還把滲壓劑保持在原來的高水平上，若干時間以后細胞就會停止分裂）。最后，將肉眼可見的細胞團轉入到不含滲壓劑的新鮮培養基中。由此可見，原生質體培養基中的滲透壓應該在細胞分裂幾次后，用滲透壓相對較低的滲壓劑來降低培養基中的滲透壓，直至用不含滲壓劑的新鮮培養基來培養細胞團。

[例3]（2016年浙江選考T32）（節選）（2）原生質體的培養：將原生質體進行培養，重新長出細胞壁，形成胚性細胞。此時，應該培養基中甘露醇濃度，以利于胚性細胞繼續培養形成細胞團，然后經兩條途徑形成再生植株。

分析：如果保持獲得原生質體時的滲透壓將會阻止細胞的分裂，從而無法獲得細胞團。

參考答案：降低。

4原生質體何時進行細胞分裂

在原生質體混合物中，一旦把酶洗掉，原生質體立即開始合成新壁。一般來說，來源于已分化的初始材料，其原生質體相比于未分化材料的原生質體合成細胞壁的能力要弱。細胞壁的形成與細胞分裂有直接關系，凡是不能再生細胞壁的原生質體也就不能進行正常的有絲分裂。凡能繼續分裂的細胞經2～3周培養后可長出細胞團。由此可見，原生質體只有在再生細胞壁后，才能進行細胞分裂。[例4]（2020年1月浙江選考T29）原生質體在培養過程中，只有重新形成后，才可進行有絲分裂。

分析：細胞壁的形成直接影響了原生質體的分裂。不能再生細胞壁的原生質體將難以進行分裂。

參考答案：細胞壁。

5原生質體的活性如何鑒定

原生質體活動檢測方法有形態觀察法、二乙酸熒光素法、酚藏花紅染色法、伊文斯藍染色體法。1形態觀察法，主要觀察原生質體形態及胞內環流。有活力的原生質體形態規則完整，顏色鮮艷，胞內環流明顯;無活力原生質體胞內渾濁，無色澤且透光，胞內環流不顯著。2酚藏花紅染色法，其原理是活性原生質體染色后在熒光顯微鏡下可觀察到紅色;而無活性原生質體無色。3伊文斯藍染色法。其原理就是死細胞或受損細胞可吸收伊文斯藍，而完整活細胞不吸收或積累該物質。4二乙酸熒光素法。該方法的原理是FDA自由穿越細胞膜，并積累在活細胞中，被活細胞酯酶酶解產生熒光素。在熒光顯微鏡下可以觀察熒光產生。而熒光素無法在死細胞中積累。因此，無活力的原生質體無熒光產生。由此可見，原生質體的活性可以通過形態觀察，著色等方法進行鑒定。

[例5]（2020年1月浙江選考T29）（1）為了獲取某植物葉片無菌的原生質體，先將葉片經表面消毒并去除下表皮，再將其置于經滅菌處理的較高滲透壓的混合酶液中。酶解后，經多次離心獲得原生質體。然后測定該原生質體的活性，可采用的方法有（答出2點即可）。

分析：該題中提到的染色法，可以是酚藏花紅染色法，也可以是伊文斯藍染色法，也可以參考浙科版教材中“驗證活細胞吸收物質的選擇性”活動中的紅墨水染色。還可以用形態觀察法，觀察胞質環流的情況。該題中提到的滲透吸水失水，是參考浙科版教材中“觀察洋蔥表皮細胞的質壁分離及質壁分離復原”活動，能發生滲透吸水失水的是活細胞。

參考答案：染色法、滲透吸水失水。

參考文獻：

[1]陳勁楓.植物組織培養與生物技術[M].北京：科學出版社，2018.

[2]李浚明朱登云.植物組織培養教程[M].北京：中國農業大學出版社，2005.

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