錯(cuò)配修復(fù)蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義研究

陳東，張丹鳳，賴(lài)燕妮

（廣東省興寧市人民醫(yī)院，廣東 興寧 514526）

0 引言

結(jié)直腸癌屬于臨床常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，具有較高發(fā)病率及病死率，隨著人們飲食、生活習(xí)慣的改變以及人口老齡化加劇等因素，導(dǎo)致該疾病發(fā)病率與病死率呈增高趨勢(shì)[1-2]。在早期時(shí)，該疾病主要臨床表現(xiàn)為患者排便發(fā)生改變，如大便時(shí)出血等，難以引起患者重視，隨著病情逐漸發(fā)展，患者容易出現(xiàn)黏液血便、下腹疼痛等問(wèn)題，一旦患者未得到有效、合理治療，則會(huì)危及到患者生命安全?，F(xiàn)階段中，臨床認(rèn)為結(jié)直腸癌的形成途徑有兩種，即MSI（微衛(wèi)星不穩(wěn)定）與CIN（染色體不穩(wěn)定），其中CIN 途徑占比率較高，主要是因MCC、APC、p53 及DCC 等抑癌基因及RAS 等部分癌基因突然發(fā)生變化，受多因素共同發(fā)生作用前提下，在不同的階段誘發(fā)所致；而MSI 是由于MMR 基因缺陷所造成的[3-4]。鑒于此，本研究以我院60 例結(jié)直腸癌患者為例，目的是為了分析MSI 的表達(dá)情況以及其與臨床病理之間關(guān)系，現(xiàn)展開(kāi)具體分析與匯總。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以回顧性分析法對(duì)2019 年1 月-2020 年10 月廣東省興寧市人民醫(yī)院就醫(yī)的60 例結(jié)直腸癌患者病理資料進(jìn)行分析，其中男33 例，女27 例，年齡22～79 歲，平均（52.7±6.5）歲。本研究入組對(duì)象均滿(mǎn)足WHO結(jié)腸癌組織病理學(xué)分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為原發(fā)性結(jié)直腸癌，所有切片由我院2 位副高職稱(chēng)以上的病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)診，患者及其家屬經(jīng)臨床醫(yī)師詳細(xì)講解本研究?jī)?nèi)容后，同意參加研究，并簽署相關(guān)同意書(shū)，術(shù)前未接受過(guò)放療、化療及免疫治療者。排除復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌者、家族性腺瘤性息肉病者。

1.2 方法

以中性甲醛液（濃度為4%）對(duì)標(biāo)本實(shí)施固定處理及脫水劑石蠟包埋處理，經(jīng)持續(xù)予以切片處理后，使用蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)Envision 法進(jìn)行染色，之后對(duì)石蠟切片實(shí)施脫蠟處理與水花處理，并使用pH 值達(dá)7.4 的PSB 實(shí)施浸泡處理與沖洗處理；以H2O2（濃度0.3%）的封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，使用PSB 浸洗后，加入一抗物質(zhì)（PMS2、MLH1、MSH6、MSH2），于室溫下實(shí)施撫孵育，并將生物素標(biāo)記二抗及過(guò)氧化物酶溶液于室溫下實(shí)施孵育處理，利用DAB 進(jìn)行顯色，借助蘇木素進(jìn)行復(fù)染，最后予以常規(guī)脫水處理、透明處理與封片處理。對(duì)于脛骨檢測(cè)的每張切片，需以正常結(jié)腸黏膜上皮（或浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞）作為陽(yáng)性對(duì)照，并使用PBS 來(lái)替代一抗，將其作為陰性對(duì)照。

1.3 指標(biāo)觀察及判定標(biāo)準(zhǔn)

統(tǒng)計(jì)MSI 具體表達(dá)情況與患者基礎(chǔ)資料、臨床病理的關(guān)系。由于MMRP 中的MSH2、MSH6、MLH1及PMS2 位置都在細(xì)胞核，故而以半定量積分法來(lái)測(cè)定。①陽(yáng)性細(xì)胞百分比為0 分，表示無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；為1 分，則≤10%；為2 分，則在11%～50%；為3 分，則在51%～80%；為4 分，則>80%；②染色強(qiáng)度：分為4個(gè)階段，其中0 分代表無(wú)色；1 分代表淺黃色；2 分代表棕黃色；3 分代表棕褐色。所得積分進(jìn)行相乘處理后，若得分顯示為0 分，則表示蛋白呈缺失狀態(tài)；若得分顯示1 分，則表示蛋白呈低表達(dá)狀態(tài)；若得分>2 分，則表示蛋白呈陽(yáng)性，其中蛋白缺失與蛋白低表達(dá)均當(dāng)作陰性。將在MMRP 中表達(dá)若缺失1 種及1 種以上的設(shè)為MSI 組。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)以SPSS 23.0 分析，分別以%與t值代表計(jì)數(shù)資料與計(jì)量資料，以χ2與（）進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05 顯示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析MSI表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者基礎(chǔ)資料的關(guān)系

由表1 可知，MSI 與患者的年齡有關(guān)（P<0.05），與患者性別無(wú)關(guān)（P<0.05）。

表1 分析MSI表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者基礎(chǔ)資料的關(guān)系[n（%）]

2.2 分析MSI表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者臨床病理關(guān)系

由表2 可知，MSI 與患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；與患者浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P>0.05）。

表2 分析MSI表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者臨床病理關(guān)系[n（%）]

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于中老年群體當(dāng)中，其發(fā)生與遺傳、環(huán)境等因素有密切關(guān)聯(lián)，具有較高病死率與發(fā)病率[4]。在疾病早期時(shí)，患者無(wú)顯著臨床癥狀存在，隨著疾病加重，可累及四周組織，促使患者發(fā)生腸梗阻等癥狀，臨床表現(xiàn)為隱痛、腹脹、嘔吐等，嚴(yán)重影響到患者機(jī)體健康與生命。在臨床上主要采取根治性手術(shù)方式，通過(guò)將患者病灶切除，并結(jié)合放療、化療等輔助治療方式來(lái)控制患者病情。故而，盡早診斷予以診斷治療，可有效改善其癥狀，減少病死風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，還能夠起到改旱患者預(yù)后的作用[5-6]。雖然大多數(shù)早期結(jié)直腸癌患者可得到5 年的生存率，然而若患者屬于轉(zhuǎn)移性直腸癌，那么其5 年生存率較低，可見(jiàn)在結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)死亡的原因中，主要原因是轉(zhuǎn)移，故而深入研究結(jié)直腸癌疾病的發(fā)病機(jī)制，有利于臨床對(duì)該疾病及早進(jìn)行診斷、治療及預(yù)防。

結(jié)直腸癌疾病的發(fā)生，是涉及到多個(gè)基因改變與多步驟累及的一個(gè)過(guò)程，在結(jié)直腸癌的發(fā)生中，基因不穩(wěn)定起著重要意義，其中MMR 功能障礙則是其發(fā)生的一項(xiàng)重要機(jī)制。近年來(lái)，基于臨床深入研究MMR 基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，其能夠造成相應(yīng)DNA 修復(fù)蛋白數(shù)量與活性發(fā)生改變，故而對(duì)于腫瘤敏感性較高；有研究顯示遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌是因?yàn)镈NA中MMR 基因胚系突變，而造成DNA 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)功能發(fā)生缺陷，導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA 復(fù)制錯(cuò)誤累積，從而形成腫瘤。DNA 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是由一系列特異性修復(fù)DNA 堿基錯(cuò)配酶組成，主要功能是對(duì)DNA 復(fù)制期間所出現(xiàn)的錯(cuò)配情況進(jìn)行修復(fù)，如單堿基錯(cuò)配與2 個(gè)以上插入/缺失錯(cuò)配，繼而確保遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性與完整性，防止其出現(xiàn)突變。而堿基-堿基發(fā)生錯(cuò)配，主要對(duì)非重復(fù)DNA 序列造成影響，最終造成單堿基錯(cuò)配，以DNA 復(fù)制錯(cuò)誤為主要表現(xiàn)。一旦形成插入-缺失環(huán)，會(huì)對(duì)DNA 重復(fù)序列造成影響，導(dǎo)致短序列插入或者缺失，也可表現(xiàn)出微衛(wèi)星插入或者缺失，以微衛(wèi)星不穩(wěn)定為主。在結(jié)直腸癌檢測(cè)中，可將MMR功能缺陷作為一種初篩方法，與此同時(shí)也可通過(guò)篩選出的MMR 功能缺陷用于選擇疾病化療方案與判斷預(yù)后效果。

MSI 指的是相較于正常組織，腦瘤中某個(gè)微衛(wèi)星DNA 因重復(fù)單位缺失或者插入而導(dǎo)致微衛(wèi)星長(zhǎng)度發(fā)生改變，有新微衛(wèi)星DNA 等位基因現(xiàn)象存在[7-8]。MMRP 屬于一種核酶，參與修復(fù)增殖細(xì)胞DNA 復(fù)制產(chǎn)生的錯(cuò)配堿基，若其出現(xiàn)缺失現(xiàn)象，則將造成DNA錯(cuò)配發(fā)生聚集，進(jìn)而產(chǎn)生MSI。而MMRP 和細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及基因突變等有關(guān)，在DNA 的合成中，若出現(xiàn)保真度丟失，將會(huì)對(duì)結(jié)直腸癌疾病發(fā)生與發(fā)展造成影響。當(dāng)MMR 系統(tǒng)參與到DNA 修復(fù)過(guò)程中時(shí)，所參與的分子與酶較多，其中主要參與者有MSH2 及MLH1，通常情況下，他們會(huì)與同源性的MMR 蛋白構(gòu)成一個(gè)二聚體來(lái)發(fā)揮作用，而MLH1 和PMS2、MSH6 及MSH2 則分別形成了功能性的二聚體復(fù)合物[9-10]。在二聚體中，MLH1 與MSH2 是其主導(dǎo)蛋白，而PMS2與MSH6 則是其配對(duì)蛋白，若前者發(fā)生突變，則有可能造成二聚體蛋白出現(xiàn)降解現(xiàn)象，進(jìn)而使得主導(dǎo)蛋白及配對(duì)蛋白的表達(dá)缺失。若MLH1 蛋白表達(dá)存在缺失，那么則伴隨著PMS2 蛋白表達(dá)缺失，同樣的若MSH2蛋白表達(dá)缺失，也會(huì)導(dǎo)致MSH6 表達(dá)缺失，由此可見(jiàn)MLH1 與MSH2 表達(dá)切缺失互相排斥，二者只能存在一種蛋白表達(dá)缺失[11-12]。本研究通過(guò)分析在結(jié)直腸癌疾病中MSI 表達(dá)與疾病臨床病理間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)男性患者與女性患者M(jìn)SI 表達(dá)陽(yáng)性與陰性率差異較大（P<0.05）；而年齡>50 歲與≤50 歲患者M(jìn)RI 表達(dá)陽(yáng)性、陰性率差異較?。≒>0.05），可見(jiàn)MSI 與患者的年齡有關(guān)，與患者性別無(wú)關(guān)；且MSI 與患者腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；與患者浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P>0.05），可見(jiàn)MSI 蛋白表達(dá)情況與疾病病例特征有關(guān)，有利于臨床對(duì)遺傳性結(jié)直腸癌疾病進(jìn)行篩選。

綜上所述，MSI 蛋白表達(dá)和結(jié)直腸癌疾病臨床病理特征有密切關(guān)聯(lián)，通過(guò)對(duì)MMRP 進(jìn)行檢查，可深入了解疾病特點(diǎn)，進(jìn)而幫助臨床早期確診，從而制定出相應(yīng)治療方法，提高患者生存率。