抗條銹病小偃麥附加系CH366 的FISH 鑒定

鄭 瑗，李 欣，賈舉慶，郭慧娟，雷夢林，張樹偉，常利芳，暢志堅，喬麟軼，陳 芳，張曉軍

（1.山西大學生物工程學院，山西太原 030006；2.山西農業大學農學院，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原 030031；3.山西農業大學農業基因資源研究中心，農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，山西太原 030031）

小麥條銹病是由條銹病菌引起的靠風力傳播的毀滅性病害，具有傳播迅速、傳播范圍廣、產量損失大的特點，嚴重危害了我國小麥的生產[1]。近年來，由于種植結構的改變，大量矮稈的小麥品種投入生產，使得株間環境更適合條銹病原菌傳播，條銹病危害日益嚴重。由于條銹病小種的變異使得已有的抗條銹病基因逐漸喪失抗性，選育新的小麥抗條銹病基因資源并將其應用于育種與生產是解決條銹病危害的有效途徑[2]。

中間偃麥草作為小麥的近緣物種，是小麥改良的三級基因源之一，抗寒，分蘗能力強，蘊含豐富的抗病基因。目前普遍認為，中間偃麥草的基因組型為JJJsJsSS，其中，J 基因組、JS基因組與小麥的B 基因組十分接近，因此，容易與小麥雜交，中間偃麥草應用十分廣泛[3]。H.B.齊津[4]將小麥與中間偃麥草進行遠緣雜交，選育出小冰麥系列新品種；孫善澄[5]利用小麥與中間偃麥草多次雜交后回交并定向選擇的方法選育出中1～中5，在抗病方面的應用非常廣泛。CHANG 等[6]利用普通小麥與中間偃麥草雜交獲得TAI7044、TAI7045、TAI8335 等多個八倍體小麥，并繼續與小麥雜交、回交，選育出CHadd7001、CHadd7002[7]、CH13-21[8]等多抗性附加系與易位系。石丁溧等[9]選育出抗白粉病和條銹病的異附加系AF-2，并通過GISH 證明了有2 條染色體來源于中間偃麥草。

CH366 是山西農業大學農學院利用普通小麥晉太170 與小麥-中間偃麥草部分雙二倍體TAI7045 雜交，F1代與晉太170 再回交，回交后代經過多次自交得到的體細胞為44 條染色體的小偃麥新品系。本研究通過細胞學方法對CH366 進行了熒光原位雜交（FISH）鑒定，同時進行抗病性分析，以期為小麥遺傳改良與抗病育種提供穩定且優良的中間材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料CH366、親本晉太170、TAI7045 和對照品種臺長29、SY95-71 均由作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室保存并提供。CH366 是由晉太170 與TAI7045 雜交后回交得到；TAI7045 是由暢志堅用普通小麥和中間偃麥草雜交培育的部分雙二倍體；晉太170 是由山西省農業科學院作物科學研究所選育的國審優質強筋小麥品種。

1.2 染色體制片

有絲分裂中期染色體制片參考HAN 等[10]的方法，略有改動。取50 粒CH366 種子在4 ℃冰箱放置2 d，室溫下晾干。放在5 個培養皿中培養，每個培養皿鋪2 層濾紙潤濕后放入10 粒種子，在室溫黑暗環境下培養2 d。待根尖長到2 cm 左右，放入4 ℃冰箱處理24 h。在每粒種子上剪取1 cm 左右的根尖分別放到2 mL 噴濕離心管中，然后在0.9 MPa N2O 罐處理2 h。用90%醋酸固定10 min，水洗3 次，切取根尖分生區置于2%的果膠酶和纖維素酶中，37 ℃水浴60～65 min。取出后用70%乙醇洗2 次，無水乙醇洗1 次。用解剖針搗碎根尖后，4 000 r/min離心3 min。倒掉乙醇后在室溫下晾干，然后加入適量冰醋酸，攪拌均勻后用移液器吸取6.5 μL 混合液滴于載玻片上，15 min 后用顯微鏡觀察染色體中期分裂相，選取染色體完整且分散好的片子保存。

1.3 熒光原位雜交分析

選取多聚寡核苷酸探針Oligo-pTa535-1 和Oligo-pSc119.2-1[11]進行雙色熒光原位雜交，雜交程序參照LANG 等[12]的方法，并參照TANG 等[11]的方法對分散的染色體進行命名。用Leica DM2 熒光顯微鏡進行鏡檢，DFC500 CCD 拍照。選擇分裂相明顯且清晰的細胞進行核型分析，以獲得可靠的證據。

1.4 抗病性鑒定

2019—2020 年度分別在四川省農業科學院現代農業科技示范園和山西農業大學東陽試驗示范基地種植親本晉太170、TAI7045 和CH366。在四川成都基地人工接種條銹菌最新流行小種條中32、條中33、條中34 混合小種，感病對照選擇臺長29，誘發品種為川育12，進行條銹病抗性鑒定。在東陽基地人工接種白粉菌株E09，感病對照是SY95-71，誘發品種為SY95-71，進行白粉病抗性鑒定。測試材料對條銹病和白粉病的抗性均按照6 級反應型進行記載[13-14]，分別為0（免疫）、0；（近免疫）、1（高抗）、2（中抗）、3（中感）、4（高感）。

2 結果與分析

2.1 CH366 的染色體數目鑒定

取50 粒CH366 的種子發芽并取其根尖進行有絲分裂中期染色體制片，選取細胞完整且染色體分散好的片子進行染色體數目統計。由圖1、2 可知，50 粒種子的染色體數目均為44 條，比普通小麥的42 條染色體多2 條，表明CH366 中可能含有2 條不屬于普通小麥的染色體。

2.2 CH366 的FISH 鑒定

以分別標記了紅色和綠色熒光標記的Oligo-pTa535-1 和Oligo-pSc119.2-1 探針對CH366進行熒光原位雜交（FISH），并對其染色體進行分組與核型分析，結果發現，CH366 中有42 條染色體與小麥親本晉太170[15]染色體結構、熒光信號基本一致，另2 條染色體在長臂末端和短臂上接近著絲粒的位置含有較強的紅色雜交信號，與普通小麥的染色體具有明顯區別。且這2 條染色體形態與雜交信號完全一致，這表明CH366 中含有1 對來源于TAI7045 或中間偃麥草的染色體，CH366 可能是一個小麥-中間偃麥草異附加系。

2.3 CH366 的抗病性鑒定

在山西農業大學東陽試驗示范基地進行CH366 成株期白粉病鑒定。結果顯示，TAI7045 對白粉病的反應型為0 級，表現為免疫；CH366 和晉太170 的反應型均為4 級，表現為高感白粉病；說明CH366 中可能不含有抗白粉病基因。在四川省農業科學院現代農業科技示范園進行CH366 成株期條銹病鑒定。結果顯示，晉太170 對條銹病的反應型為4 級，表現為高感條銹病。CH366 的反應型為0；級，表現為近免疫；TAI7045 的反應型為0 級，表現為免疫；CH366 與TAI7045 的條銹病抗性基本一致，表明CH366 中的抗條銹病基因可能來源于其所含有的1 對外源染色體，即來源于TAI7045 或中間偃麥草。

3 結論與討論

小麥的遠緣雜交可以將外源染色體導入小麥中，豐富小麥的遺傳背景，創造新的種質資源，為發展小麥產業做出貢獻。檢驗是否有外源染色體最直觀、快速的方法就是原位雜交技術。建立FISH 核型圖可以一目了然地觀察到外源染色體形態與數目。最初，TSITSIN[16]通過遠緣雜交創造出小麥-中間偃麥草部分雙二倍體，之后有大批附加系、代換系如雨后春筍般涌現。韓方普等[17]利用原位雜交對小偃麥異附加系TAI-14 進行鑒定，發現變異的染色體來自于中間偃麥草，且附加系會再次發生變異，產生了雙端體異附加系TAI-14t。杜萬里[18]對一系列小麥-華山新麥草衍生后代進行原位雜交，篩選出全套二體附加系。本試驗對小麥-中間偃麥草后代CH366 進行了FISH 鑒定和核型分析，證實CH366 是一個二體異附加系，包含小麥全套基因組，并添加了2 條外源染色體。添加的2 條外源染色體具體類型需要使用分子標記鑒定和其他技術手段來確定。

國內外學者通過中間偃麥草與小麥雜交選育出多個對小麥抗病、抗寒等性狀具有改良作用的基因資源。GAUDERON[19]育成的小麥-中間偃麥草雙二倍體TAF46，對小麥凍害與春季低溫具有極強的抗性；孫善澄等選育的中4 和中5[5]含有黃矮病的抗性；LIU 等[20]利用普通小麥煙農15 與中間偃麥草育成的部分雙二倍體E990256，高抗白粉病。部分雙二倍體由于含有較多的外源染色體，農藝性狀普遍較差，難以在育種或生產上直接應用。附加系作為外源基因向小麥轉移的中間材料，僅含有1 對外源染色體，減少了外源染色體對小麥基因組的影響，更易于與小麥雜交，因此，附加系的選育對創制新的小麥種質資源、擴展小麥遺傳基礎具有重要意義。本試驗選育并鑒定的異附加系CH366 對條銹病表現為近免疫，其小麥親本晉太170 高感條銹病，因此，推測其條銹病抗性來自其所含有的外源染色體，即其抗條銹病基因來自中間偃麥草。但CH366 作為一個二體異附加系，仍含有較多的外源染色體，易受外源物種不良基因的影響，不利于在小麥育種中應用，因此，在生產實踐中，需要利用其與普通小麥再次雜交，利用ph1b 基因誘導或輻射技術，依次創造出代換系和含有不良外源基因較少的小片段易位系。