復方中藥治療雞大腸桿菌病效果、機理及藥物安全性初探

武怡荷，楊繼業，陳書明，張希春，陳亞偉，王軍艷，趙蘇蘇，呂 冰

（1.山西農業大學動物醫學學院，山西太谷 030801；2.山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西晉中 030619；3.山西省畜牧遺傳育種中心，山西太原 030027）

雞大腸桿菌是一種條件致病菌，其血清型眾多，臨床病型復雜，傳染性強[1]。隨著養雞業的規模化，該病常造成雞只發病死亡，使其生產性能大大降低，給養雞業造成巨大經濟損失。目前，國內外治療用藥主要有氟苯尼考、諾氟沙星等抗生素[2-3]，但存在以下缺點：（1）在畜禽產品中有害藥物殘留量大，導致很多食品安全問題的發生；（2）長期應用，會產生耐藥菌。所以，老疫區靠抗生素等西藥很難有效控制疫情，因而常有大規模的疫情發生、蔓延，給養雞業造成致命打擊。因此，研制安全、高效的防治禽大腸桿菌病的藥物是當代獸醫工作者急需解決的重大課題。

近年來，大量研究發現，清熱類與補益類中草藥可通過直接清除大腸桿菌毒素、影響大腸桿菌核酸或蛋白的合成與代謝或調節機體免疫功能治療禽大腸桿菌病，其在臨床應用中具有廣闊前景[4-6]。山西農業大學動物醫學學院中獸藥研發團隊與山西偉業生物技術有限公司合作，根據中醫中藥理論及多年的臨床實踐經驗，以穿心蓮、白扁豆、黨參、蒼術、秦皮等為基礎，研制出對雞大腸桿菌病有較好療效的復方中藥。筆者就該復方中藥對大腸桿菌的抑菌效果、雞大腸桿菌病的療效以及雞紅細胞免疫指標的影響、藥物安全性進行了初步研究，旨在探索該復方中藥扶正固本，清熱解毒的機制，為防治雞大腸桿菌病中藥制劑研發提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

復方中藥：根據中醫中藥配伍原則，由穿心蓮、白扁豆、黨參、蒼術、秦皮等配伍而成，由山西偉業生物技術有限公司提供。

實驗動物：KM小鼠（18～22 g），購自山西醫科大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（晉）2015-0001。

氟苯尼考（100 g 含氟苯尼考30 g）由廣州市匯邦動物藥業有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 病例來源與診斷 2020 年4 月，文水某雞場4 周齡雞群患病，病雞精神不振，食欲減退，拉黃白色稀便且肛門被糞便污染，部分雞腳麻痹，每天死亡5～6 只。剖解死亡病雞可見，肝臟腫大變脆，腹腔中有少量黃色滲出物，腸粘膜充血、出血。采集死亡不久的完整雞肝臟，在無菌環境中使用肝臟切面涂布普通培養基與麥康凱培養基。普通培養基生長出濕潤、光滑的圓形半透明菌落；麥康凱瓊脂培養基上出現圓形紅色菌落；經生化鑒定試驗[7]，鑒定為大腸桿菌。根據流行病學特征、臨床癥狀、剖解病變及病原菌的鑒定，最終確診為雞大腸桿菌病。

1.2.2 復方中藥藥液的制備 取上述復方中藥粉劑40.0 g，采用傳統煎煮方法煎煮20 min，用無菌紗布過濾后將藥液濃縮至40.0 mL，此時藥液濃度為1.0g/mL。將該藥液稀釋，最后得到0.25g/mL、0.5 g/mL、1.0 g/mL 復方中藥藥液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 氟苯尼考藥液制備 以100 g 藥對150 kg 滅菌水的比例配制，即得0.2 mg/mL 氟苯尼考藥液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.4 被分離大腸桿菌藥敏試驗 根據李心海等[8]使用的方法測定大腸桿菌對上述藥物的敏感性。用直徑為6 mm 的打孔器將定性濾紙制作成若干小圓片，高壓滅菌后將其分成4 份，1 份滅菌濾紙片用0.2 mg/mL 氟苯尼考藥液浸泡5 min，使每個紙片含藥量為30 μg，其余3 份滅菌濾紙片分別用0.25、0.5、1.0 g/mL 相同體積的復方中藥藥液浸泡5 min，取出放入滅菌培養皿中干燥。使用涂布棒將菌液（1.5×108cfu/ml）均勻地涂布于營養瓊脂培養基上，將標記好的4 種藥敏片貼于培養基上，每種藥物重復放3 個，重復4 個培養皿。37 ℃恒溫培養24 h 后，測定每個藥敏片的抑菌圈直徑，并計算平均直徑。

1.2.5 復方中藥對雞大腸桿菌病臨床療效 將文水某雞場被確診為雞大腸桿菌病的830 羽病雞隨機分為5 組，對照組（30 羽雞，不予治療），其余分成4 組，每組200 羽雞，分別用0.25、0.5、1.0 g/mL 復方中藥藥液，0.2 mg/mL 氟苯尼考藥液進行飲水治療，治療3 d，統計治愈率、好轉率、無效率及死亡率。

1.2.6 雞紅細胞C3bR 花環率、免疫復合物（IC）花環率的測定[9]根據文獻[10]制備酵母菌與紅細胞的菌懸液，將C3b 致敏酵母菌懸液和經藥物治療后的雞紅細胞懸液混勻，37 ℃水浴40 min，經戊二醛固定、涂片、干燥、甲醇固定后染色鏡檢，計算C3bR花環率。IC 花環率測定中所用酵母菌懸液不致敏，其余操作同C3bR 花環率試驗。

1.2.7 復方中藥安全性試驗

1.2.7.1 急性毒性試驗 取6 g 復方中藥樣品研細，過120 目篩后用蒸餾水稀釋成20 mL 混懸液，藥物質量濃度為0.3 g/mL。選用18～22 g小鼠20 只，隨機分為2 組，雌雄各半。大部分中藥及其制劑毒性較小，常難以準確測出其LD50，因此，常用最大給藥量來測定試驗動物對中藥的耐受量[11-12]。按最大給藥量20 mL/kg，計算出本研究中藥給藥劑量為6 000 mg/kg，經口灌胃給藥，對照組予以等量生理鹽水。觀察動物的一般狀況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期為14 d[13]。

1.2.7.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 根據張林等[14]提供的方法，將50 只KM 小鼠隨機分為5 組，雌雄各半。按3 個劑量組（當受試藥物LD50＞5 000 mg/kg 時，5 000 mg/kg 設為高劑量組，2 500、1 250 mg/kg 設為中、低劑量組）和2 個對照組（陰性對照為蒸餾水，陽性對照為環磷酰胺50 mg/kg）進行試驗，計算微核率。

1.3 數據分析

將試驗數據用SPSS 20.0 軟件進行處理，以平均數±標準差（X±SD）表示，比較各組的差異顯著性，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 復方中藥與氟苯尼考對大腸桿菌的抑制作用

由表1 可知，氟苯尼考的抑菌圈直徑顯著高于復方中藥組（P＜0.05），表明氟苯尼考的體外抑菌能力強于復方中藥；復方中藥對被分離的大腸桿菌也具有一定的抑菌能力，且這種能力與質量濃度大小有關，0.5、1.0 g/mL 復方中藥組間抑菌圈直徑無顯著差異（P＞0.05），且兩者顯著高于0.25 g/mL 復方中藥組（P＜0.05），表明0.5、1.0 g/mL 復方中藥對大腸桿菌抑菌能力相當，且顯著高于0.25 g/mL 復方中藥。

表1 復方中藥及氟苯尼考對被分離大腸桿菌的抑菌結果

2.2 復方中藥與氟苯尼考對雞大腸桿菌病的療效

從表2 可以看出，與不予治療組相比，使用藥物治療后，患病雞無效率與死亡率均明顯降低，0.25 g/mL 復方中藥組患病雞的治愈率與好轉率最低，0.5、1.0 g/mL 復方中藥組療效優于0.25 g/mL 復方中藥組，且明顯優于氟苯尼考組的治療效果。

表2 復方中藥與氟苯尼考對雞大腸桿菌病的療效 %

2.3 復方中藥與氟苯尼考對感染大腸桿菌病雞紅細胞免疫指標的影響

由表3 可知，經藥物治療3 d 后，患病雞紅細胞C3bR 花環率顯著增高，其中，經0.5、1.0 g/mL 復方中藥組治療后雞紅細胞C3bR 花環率顯著高于其他組（P＜0.05）；而經藥物治療3 d 后，患病雞紅細胞IC 花環率無顯著變化（P＞0.05）。

表3 復方中藥與氟苯尼考對感染大腸桿菌病雞紅細胞免疫指標的影響 %

2.4 復方中藥的安全性試驗

2.4.1 復方中藥對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響 復方中藥對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響如表4 所示。

表4 復方中藥對小鼠骨髓嗜多染紅細胞（PCE）微核率的影響

微核率反映了細胞內遺傳物質的損傷程度。從表4 可知，環磷酰胺陽性對照組微核率顯著升高，說明本試驗結果可靠。各劑量復方中藥組之間無顯著差異（P＞0.05），且均與陰性組無顯著差異（P＞0.05），表明各劑量復方中藥未對小鼠骨髓嗜多染紅細胞遺傳物質造成損傷。

2.4.2 復方中藥對小鼠的急性毒性 經胃染毒后，小白鼠無不良反應和死亡情況。根據急性毒性劑量分級標準，小鼠經口攝入復方中藥后LD50＞5000mg/kg，屬實際無毒物質[15]。

3 結論與討論

本研究選用扶正固本、清熱解毒的一種復方中藥對文水某雞場的大腸桿菌病雞進行治療，并以氟苯尼考作為對照組，結果表明，0.5、1.0 g/mL 劑量的復方中藥對患病雞具有較高的治愈率，效果優于氟苯尼考。屈倩等[16]使用中藥復方加味穿心蓮散治療35 周齡大腸桿菌病雞，顯著降低了雞的死亡率（11.67%），但仍大于本研究中0.5、1.0 g/mL 復方中藥組死亡率（均為2.0%）。在體外抑菌試驗中，0.5、1.0 g/mL 復方中藥組雖對分離的大腸桿菌具有一定的抑制作用，但其抑菌作用顯著低于氟苯尼考組，可推測復方中藥療效優于氟苯尼考的原因不在于其抑菌作用。

近年來，研究者對穿心蓮、白扁豆等做了很多研究，證明其具有抗炎、抑菌、調節免疫等作用，尤其在調節免疫方面，在現代臨床上具有廣泛應用[17-18]。反映紅細胞膜上空位C3bR 多少的指標—紅細胞C3bR 花環率的高低可反映紅細胞免疫功能的強弱，而紅細胞免疫功能的強弱又會影響白細胞的免疫功能。因此，紅細胞膜上的受體是機體免疫的基礎。本研究表明，各組紅細胞IC 花環率差異并不顯著，但復方中藥組與對照組相比，紅細胞C3bR 花環率顯著升高，且隨著藥物劑量增加而升高。這一結果顯示，本試驗所用復方中藥可增強感染大腸桿菌病雞紅細胞免疫功能，且與用藥劑量有關，0.5 g/mL的用藥劑量既經濟，治療效果又最佳。艾軍[19]用固本方治療大腸桿菌病雞，研究發現，中藥能顯著增強雞紅細胞C3bR 花環率，與本試驗結果相吻合。分析該復方中藥的藥效機理可能是：一方面抑制病原菌在雞體內繁殖，更重要的是通過調節機體免疫功能，提高機體自身的抗病力，從而達到治療的目的。

由于中藥成分的復雜性，其化學組成研究相對薄弱，在臨床應用時必須考慮到其安全性。本研究對復方中藥進行了急性毒性與遺傳毒性試驗，該復方中藥對小鼠經口攝入LD50＞5 000 mg/kg，故可以證實其屬實際無毒物質。微核是骨髓內未成熟紅細胞受環磷酰胺等化學誘變劑作用而發生的一種表現，微核率的高低反映了細胞內遺傳物質的受損程度[20]。本研究中的復方中藥對小鼠骨髓嗜多染紅細胞無致微核作用，即對機體的遺傳物質無損傷作用，說明其無遺傳毒性。夏勇等[21]研究發現，高劑量的某復方中藥制劑對大鼠有肝、腎毒性，說明中藥對動物機體存在一定的毒性，因此，還需對本試驗復方中藥的重金屬、砷等有害物質含量以及亞急性毒性做進一步研究。