亞甲基藍(lán)多克隆抗體的制備與鑒定

黃宣運(yùn)，楊光昕，史永富，黃冬梅，葉洪麗，蔡友瓊

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 200090；3.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；4.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306）

亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）是一種吩噻嗪類(lèi)化合物［1］，最早被用于工業(yè)染色和治療細(xì)菌性瘧疾。近年來(lái)，亞甲基藍(lán)被用于替代禁用藥物孔雀石綠［2］防治水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中的水霉病［3］。與孔雀石綠相比，亞甲基藍(lán)毒性較低，但依然存在副作用［4-5］。目前，歐盟規(guī)定禁止亞甲基藍(lán)用于動(dòng)物食品生產(chǎn)過(guò)程，日本規(guī)定動(dòng)物食品中亞甲基藍(lán)最高殘留限量為10μg·kg-1［6］。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快捷的檢測(cè)亞甲基藍(lán)的方法顯得十分必要。

現(xiàn)有檢測(cè)動(dòng)物源性食品中亞甲基藍(lán)殘留的方法主要有儀器法和免疫學(xué)分析法，儀器法主要包括紫外分光光度法［7-8］、液相色譜法［9］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［10］等。與儀器法相比，免疫學(xué)分析法具有靈敏、快速、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，更適合用于水產(chǎn)品藥物殘留的初步篩查［11-13］。目前，基于免疫學(xué)原理開(kāi)發(fā)的快速檢測(cè)方法主要針對(duì)氟喹諾酮類(lèi)［14-15］、孔雀石綠［16］等指標(biāo)，對(duì)于亞甲基藍(lán)尚未有相關(guān)研究報(bào)道。

本研究以亞甲基藍(lán)代謝物天青C（azure C）作為亞甲基藍(lán)的半抗原，采用戊二醛法合成亞甲基藍(lán)人工抗原，并制備和鑒定了亞甲基藍(lán)鼠源多克隆抗體，以期為下一步制備亞甲基藍(lán)單克隆抗體及開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)試劑盒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

亞甲基藍(lán)，含量≥98.9%，購(gòu)自USP美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)品公司；天青A，含量≥99.0%，購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；天青B，含量≥95.1%，購(gòu)自北京正翔科技有限公司；天青C，含量≥90%，購(gòu)自Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum album，BSA）、雞卵血清白蛋白（ovalbumin，OVA）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（酶標(biāo)二抗）、96孔酶標(biāo)板、50%戊二醛（GA），購(gòu)自生工生物工程（上海）公司；弗氏完全、不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司；BALB／c小鼠購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，許可證號(hào)為：SCXK（滬）2017-0012。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于華東師范大學(xué)閔行校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為：SYXK（滬）2015-0011。

本實(shí)驗(yàn)所用其他生物試劑純度均大于98%，化學(xué)試劑均為分析純及以上純度。

Multifuge X3R離心機(jī)（賽默飛世爾（上海）儀器公司），U4100紫外分光光度計(jì)（株式會(huì)社日立制作所，日本），Multiskan MK3酶標(biāo)儀（賽默飛世爾（上海）儀器公司）。

1.2 亞甲基藍(lán)人工抗原的合成

參考滕海英等［17］的方法，對(duì)人工抗原進(jìn)行合成。稱(chēng)取3.5 mg天青C溶解于2 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS 0.01 mol·L-1，pH 7.2）中，加入50 μL 50% 戊二醛（GA）反應(yīng)1 h。在室溫磁力攪拌下，逐滴加入0.85 mL 20 mol·L-1的BSA溶液，再加入1.1mL PBS緩沖液，反應(yīng)24 h。將溶液轉(zhuǎn)移至處理好的透析袋中，并以PBS溶液為透析液在4℃透析3 d，每天更換透析液3～4次。透析后即為亞甲基藍(lán)人工抗原（azure C-BSA），4℃保持備用，其合成路線(xiàn)見(jiàn)圖1。azure C-VOA的制備方法與azure C-BSA一致，將OVA替換BSA即可。

1.3 亞甲基藍(lán)人工抗原的鑒定

1.3.1 紫外掃描鑒定

用PBS將BSA、OVA、天青C和人工抗原稀釋至適當(dāng)濃度后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行表征。

1.3.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MADLI-TOFMS）鑒定

人工抗原委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行鑒定。具體方法如下：取1μL樣品點(diǎn)至樣品靶上，自然干燥后，再取CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品。在正離子模式下選擇線(xiàn)性方法對(duì)樣品測(cè)試分子量。通過(guò)比較偶聯(lián)蛋白、半抗原及人工抗原的分子量，計(jì)算偶聯(lián)比。

圖1 亞甲基藍(lán)人工抗原合成路線(xiàn)Fig.1 Synthetic route of MB artificial antigen

1.4 多克隆抗體制備

挑選4只健康的6周齡的BALB／c小鼠，暫養(yǎng)1周后，免疫前眼眶取血作為陰性血清。取2 mg·mL-1免疫原（azure C-BSA）與弗氏完全佐劑等量混合，腹腔注射小鼠，免疫劑量為0.2 mg。首次免疫后2周，免疫原與弗氏不完全佐劑混合乳化，腹腔注射。以后免疫不加佐劑，分別在第3周、第4周、第5周各免疫一次，采用尾部靜脈注射免疫。最后一次免疫后，摘眼球取血，離心分離血清后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 多克隆抗體的鑒定

1.5.1 抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法（ELISA）檢測(cè)抗體效價(jià)。將包被原稀釋400倍后加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，37℃包被1 h。棄去廢液，PBST（0.5% Tween-20）洗板3次（以下簡(jiǎn)稱(chēng)洗板），拍干。每孔加入200μL的PBS（5%的牛奶）封閉過(guò)夜，洗板，拍干，每孔加入100μL倍比稀釋抗體，同時(shí)設(shè)置空白和陰性對(duì)照，37℃，1 h。洗板，拍干后加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗（1∶2 000稀釋?zhuān)?7℃，0.5 h，洗板，拍干。每孔添加新配置的TMB顯色液100μL，37℃，10min，加入2M H2SO450μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm讀數(shù)。以上清液吸光度為陰性值吸光度2倍（即P／N≥2.0）判斷為陽(yáng)性。

1.5.2 抗體靈敏度測(cè)定

利用方陣法，以O(shè)D450為1.0時(shí)，作為抗原抗體最佳反應(yīng)濃度，配置不同濃度MB標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)不同濃度MB條件下的OD450，采用四參數(shù)Logisitic擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，公式為y=A2+（A1-A2）/［1+（X/X0）P］，其中A1為最大吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，A2為最小吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，X0為半數(shù)抑制濃度（IC50）對(duì)應(yīng)的MB濃度，P為斜率。

1.5.3 抗體特異性測(cè)定

以亞甲基藍(lán)代謝物天青A、天青B、天青C、孔雀石綠和結(jié)晶紫等作為競(jìng)爭(zhēng)物，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定多抗對(duì)各競(jìng)爭(zhēng)物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。交叉反應(yīng)率（cross reactivity，CR）為MB的IC50與各競(jìng)爭(zhēng)物的IC50的百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原的選擇

亞甲基藍(lán)是一個(gè)小分子化合物，其分子量只有319.9 Da，必須連接大分子物質(zhì)，如BSA、OVA和鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）等才能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體［18］。如圖2所示，MB沒(méi)有直接與蛋白質(zhì)連接的功能基團(tuán)（羧基和氨基），除了對(duì)MB進(jìn)行化學(xué)改造接入連接功能基團(tuán)外，利用結(jié)構(gòu)類(lèi)似物替代目標(biāo)物作為半抗原，是一種最為簡(jiǎn)便的策略［19］。對(duì)于亞甲基藍(lán)而言，其代謝物天青A或天青C不僅結(jié)構(gòu)與其類(lèi)似，而且有連接蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)，在本研究中選取天青C作為半抗原。

2.2 亞甲基藍(lán)人工抗原的鑒定

2.2.1 紫外掃描鑒定

紫外掃描是鑒定人工抗原是否偶聯(lián)成功最簡(jiǎn)單有效的方法［20］。在250～400 nm波長(zhǎng)條件下，對(duì)天青C、BSA、OVA和人工抗原進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖3所示，天青C、BSA、OVA、azure C-BSA和azure C-OVA的最大吸收峰分別為292 nm、278 nm、279 nm、260 nm和266 nm，與BSA和OVA相比較，人工抗原的最大吸收峰發(fā)生了藍(lán)移，證明亞甲基藍(lán)人工抗原制備成功。

2.2.2 MADLI-TOFMS鑒定

利用MADLI-TOF MS對(duì)BSA、OVA、azure CBSA、azure C-OVA的分子量進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示，BSA的分子量為66 330.2 Da，azure CBSA分子量為74 134.2 Da。BSA上連接1個(gè)天青C 分子，分子量增加為249.7（Mr，azureC-Mr，H2O=277.7-18=249.7），因此azure C-BSA的偶聯(lián)比約為31∶1，同理azure C-OVA的偶聯(lián)比約為52∶1。

圖2 不同化合物的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 M olecular structure formula of different com pounds

2.3 多克隆抗體鑒定

2.3.1 抗體效價(jià)測(cè)定

最后一次免疫后，用ELISA測(cè)定血清效價(jià)，以陽(yáng)性血清的OD450≥陰性對(duì)照的2倍作為血清的效價(jià)判斷依據(jù)。從表1可以看出，4只小鼠均產(chǎn)生了抗體，效價(jià)均在1.6×104以上，其中2號(hào)小鼠效價(jià)最高，選取該抗體進(jìn)行后續(xù)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。

圖3 人工抗原紫外掃描圖譜Fig.3 UV scanning spectrum of artificial antigen

圖4 BSA（A）、azure C-BSA（B）、OVA（C）和azure C-OVA（D）質(zhì)譜圖Fig.4 MADLI-TOF MS spectrogram of BSA（A），azure C-BSA（B），OVA（C）and azure C-OVA（D）

2.3.2 抗體靈敏度

經(jīng)方陣實(shí)驗(yàn)優(yōu)化篩選，MB間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定最佳工作條件為包被原稀釋400倍，包被酶標(biāo)板；抗體稀釋2 000倍；酶標(biāo)二抗稀釋2 000倍，反應(yīng)時(shí)間為0.5 h。按上述實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定抗體的靈敏度，利用Origin 16.0對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行四參數(shù)擬合，得到曲線(xiàn)方程為y=0.27+0.76/［1+（x/43.9）1.67］（圖5），IC50值為43.9 ng·mL-1。

2.3.3 抗體特異性

通過(guò)優(yōu)化的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定了9種物質(zhì)與抗體的交叉反應(yīng)。結(jié)果顯示（表2）：抗體與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)非常接近的天青A、天青B和天青C均有交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率（CR）分別為127.6%、84.7%和138.1%。而與水產(chǎn)品中常見(jiàn)的其他藥物幾乎不存在交叉反應(yīng)（CR＜0.01%）。由此說(shuō)明，該抗體不僅可以高特異性地識(shí)別目標(biāo)物（亞甲基藍(lán)），而且能夠識(shí)別與其結(jié)構(gòu)相似的代謝物（天青A、天青B和天青C），這為下一步開(kāi)發(fā)亞甲基藍(lán)及其代謝物快速檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

圖5 亞甲基藍(lán)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.5 Standard ELISA inhibition curve of MB

表1 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定Tab.1 Titers of polyclone antibody

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以亞甲基藍(lán)代謝物天青C作為亞甲基藍(lán)半抗原，成功合成了亞甲基藍(lán)人工抗原，免疫小鼠后，獲得的多克隆抗體效價(jià)均在16 000以上，其中2號(hào)小鼠的多抗血清靈敏度最高，IC50為43.9 ng·mL-1，與天青A、天青B和天青C均有交叉反應(yīng)，與水產(chǎn)品中常見(jiàn)其他藥物幾乎不存在交叉反應(yīng)，說(shuō)明該抗體特異性良好，為下一步制備亞甲基藍(lán)單克隆抗體及開(kāi)發(fā)免疫學(xué)快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。