異質金屬調控下醫用鎂的氫氣釋放對 腫瘤細胞的影響

姜浩淼，昝睿，彭宏州，孫鈺，張小農，鎖濤，王堅

（1.上海交通大學 材料科學與工程學院 金屬基復合材料國家重點實驗室，上海 200240； 2. 復旦大學附屬中山醫院，上海 200032； 3.上海交通大學附屬第六人民醫院 肝膽胰外科，上海 200233）

癌癥已經成為一個世界性的重大公共衛生問題，近年來，由于檢測手段的成熟，甲狀腺癌的檢測發病率在全球范圍內持續上升。這已經成為女性中第六常見的癌癥，所有人類中第十常見的癌癥，在過去一年中，新增超過52 000 例新病例[1]。在臨床上，甲狀腺癌有多種表現形式，包括較低概率產生惡行病變的甲狀腺結節，轉移能力較差的甲狀腺乳頭狀癌，能夠通過血行轉移到肺和骨頭的低分化甲狀腺癌，生長極為快速的未分化甲狀腺癌。因此，目前治療甲狀腺癌患者的最大挑戰是：找到治療良性甲狀腺腫瘤患者的輕度方案和治療晚期或高危甲狀腺癌癥患者的重度方案之間的平衡[2]。但是，目前對甲狀腺癌的治療方法通常為直接切除。為了改善這種相對“一刀切”的治療方案，研發能夠產生不同程度抑制腫瘤的藥物或植入器械的方法就顯得尤為必要。

近年來，由于鎂優秀的生物相容性[3-6]、力學相容性[7]和生物可降解性[8-10]，使其在生物醫用可降解材料的研究中成為熱點。鎂器械開始逐漸通過批準，能夠在市面上銷售使用[11-12]。許多研究表明，鎂的降解產物能夠干擾多種腫瘤細胞系的生長。Zhang 等[13]和Chen 等[14]的體外研究表明，鎂的腐蝕產物對骨肉瘤U2-OS 細胞系和MG-63 細胞系都有抑制增殖的作用。Qiao 等[15]研究了高純鎂絲的各種降解產物在一種卵巢癌SKOV3 細胞系體內和體外的生物學效應。體內成像結果表明，鎂絲植入荷瘤小鼠體內，可顯著減少腫瘤體積，并且小鼠體重維持正常。這種抗腫瘤效應與鎂金屬降解產生的氫氣關系密切。早在1975年，高壓的氫氣氣體就首次成功用于治療癌癥[16]。2007 年，Ohasawa 等[17]發現氫氣能夠在不顯著影響細胞正常生命活動的前提下，選擇性還原羥基自由基（—OH），這是活性氧（ROS）中攻擊性較強且對人體危害較大的一種。于是通過調控鎂的降解速度，使氫氣釋放速度不同，產生不同程度的抗腫瘤效果，就成為一個可行的思路。

由于鎂金屬材料電位較負，與其他金屬材料接觸時，在腐蝕電位差的驅動下，加速了腐蝕速率，即產生電偶腐蝕的現象。當電極電位有一定差距的兩種金屬材料在電解質溶液環境中相互接觸，形成能夠導電通路時，兩種材料中自腐蝕電位較負的一方成為陽極，腐蝕顯著加劇。而電位較正的一方成為陰極，其電位越高，腐蝕越輕微[18-19]。因此，文將高純鎂與三種不同的金屬（鎂合金AZ91、純鈦TA2 和不銹鋼316L）直接連接，本研究這些異質金屬對高純鎂析氫的影響及產生的抗腫瘤效應。

1 試驗

以軋制態高純鎂板（純度為99.98%，具體成分見表1）為原材料，線切割加工成12 mm×10 mm× 0.2 mm 的片狀試樣。將鎂合金AZ91、純鈦TA2 和不銹鋼316L 三種金屬板材用線切割加工成10 mm× 10 mm×1 mm 的片狀試樣。將所有試樣用800 目砂紙打磨，用無水乙醇超聲清洗，干燥。將高純鎂試樣與三種不同金屬片分別用導線相連，形成電偶對后，一并冷鑲處理，分別為Mg&AZ91、Mg&TA2 和Mg& 316L 組。固定兩種金屬之間的距離，并保證兩種金屬暴露在溶液中的面積一致。高純鎂片單獨進行冷鑲，作為Mg 組。冷鑲液的各種化學成分比例如表2所示。室溫下，約12 h 后，冷鑲液完全固化，用800目砂紙再次將表面打磨干凈，用無水乙醇超聲清洗并干燥后，進行下一步的電化學測試和浸泡試驗。

表1 高純鎂板化學成分 Tab.1 Chemical compositions of high-purity magnesium plates wt %

表2 冷鑲嵌溶液（25 g）中的化學成分 Tab.2 Chemical compositions in cold mounting and embedding solution of 25 g

電化學測試和浸泡試驗均采用PBS 緩沖溶液，具體配方為：氯化鈉（NaCl）8.0063 g/L，氯化鉀（KCl）0.2013 g/L，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.4196 g/L，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2722 g/L。

電化學測試過程為：將各組試樣在37 ℃水浴的100 mL PBS 緩沖溶液中分別浸泡20 min 與12 h，取出后，再放入新鮮的PBS 緩沖溶液中。將Mg 試樣作為工作電極，飽和Hg/HgCl 作為參比電極，Pt 作為對電極，構成三電極體系。利用電化學工作站（CHI660E，辰華），首先測量了開路電位（OCP），測量時間為300 s。然后對動電位極化曲線進行測量，掃描區間為–200～+800 mV(vs. OCP)，掃描速度為0.5 mV/s。利用Tafel 外推法，在陰極極化區獲得腐蝕電位Ec和腐蝕電流密度的對數lgJc。

浸泡試驗過程中，將各組試樣在同樣的條件下浸泡48 h。通過排水法測量48 h 內氫氣的釋放量，利用水素計（ENH-1000，TRUSTLEX）測定48 h 內溶液中氫氣濃度的變化情況。在每一個樣品對應的溶液中，都人為設定了三個測量點，以比較全面地反映溶液中的溶氫量，分別在高純鎂樣品表面上方2 mm 處，陰極金屬片樣品表面上方2 mm 處和溶液50 mm 深處。

異質金屬作用下的高純鎂電化學腐蝕和氫氣釋放特性表征結束后，在37 ℃、5%CO2環境下，將1 mL 1×105個/孔濃度的人甲狀腺腫瘤Cal-62 細胞懸液培養在六孔板細胞嵌入皿（PET Transwell Insert，JET Biofil）中。過夜貼壁后，進行換液處理，在下室中放入冷鑲好的各組高純鎂及高純鎂連接金屬片的電偶對樣品，并加入5 mL PBS 緩沖溶液，將氫氣單獨作用于Cal-62 腫瘤細胞。為保證氫氣持續釋放，對下室PBS 溶液進行換液處理，每8 h 一次。待氫氣作用后，分別進行細胞增殖、細胞凋亡和細胞周期試驗。

在細胞增殖試驗中，氫氣作用24、48、72 h 后，在避光條件下，利用CCK-8 試劑（Dojindo），通過酶標儀（ELX-800，BioTek）測試每個細胞嵌入皿溶液在450 nm 波長處的吸光度（OD 值）。OD 值與該皿中的細胞數量成正比。

在細胞凋亡試驗中，氫氣作用48 h 后，用–4 ℃預冷的PBS 溶液洗滌細胞，將細胞用不含EDTA 的胰蛋白酶（TRYPSIN 0.25%, Corning Cellgro）消化后，利用FITC/Annexin V 和PI（Sony Biotechnology）進行雙染，常溫避光孵育后，通過流式細胞儀（CytoFLEX S, Beckman）分析細胞凋亡狀況。

在細胞周期試驗中，氫氣作用48 h 后，用–4 ℃預冷的PBS 溶液洗滌細胞，將細胞消化后，用–20 ℃預冷的70%乙醇固定過夜。測試前，再次用預冷的PBS 溶液洗滌，重懸細胞。在室溫、避光環境下，用PI/RNase 綜合染劑（BD Pharmingen）進行單染，避光孵育后，通過流式細胞儀分析細胞周期。

2 結果與討論

2.1 異質金屬作用下高純鎂的電化學腐蝕特征

各組Mg 試樣在PBS 溶液中浸泡20 min 和12 h后的OCP 曲線如圖1 所示?？梢园l現，Mg 試樣連接異質金屬片后的OCP 發生了不同程度的提升，從20 min 到12 h，這種提升顯著增大，且保持著Mg< Mg&AZ91

各組Mg 試樣在PBS 溶液中浸泡20 min 和12 h后的極化曲線如圖 2 所示。將掃描區間起點定為–200 mV(vs. OCP)，主要是因為在強陰極極化條件下，很有可能生成氫化鎂產物[20]。在這種狀況下，不僅電流測量值會有額外增量，氫化鎂的生成也會導致鎂金屬表面狀態的變化，使測量值不夠準確。

極化曲線上，lgJ 最小的點對應的縱坐標為Ec值。在陰極極化區曲線上縱坐標為–100 mV(vs. OCP)處作切線，獲得陰極區的塔菲爾曲線。該切線上縱坐標為Ec值的點所對應的橫坐標，表示該試樣的腐蝕電流密度lgJc。通常情況下，塔菲爾外推法的過程為：在表觀極化曲線上確定強陰極極化區和強陽極極化區，這兩條曲線近似為直線，通過擬合這兩條直線，交點代表陰陽極的電流密度絕對值相等，外測電流為零，其對應的縱坐標和橫坐標分別為腐蝕電位和腐蝕電流密度。但是對于鎂這種金屬而言，當鎂在陽極極化時，負差數效應會引起異常的析氫，影響測定真實陽極電流密度[21]。因此在本研究中，我們只用陰極極化相對較弱的區域擬合塔菲爾曲線。

各組Mg 試樣在PBS 溶液中浸泡20 min 和12 h后的Ec和lgJc統計在表3 中。腐蝕電流密度的增大程度與腐蝕電位在極化作用下的增大程度一致，為Mg

圖1 Mg 試樣的OCP 曲線 Fig.1 OCP curves of Mg samples: a) soak for 20 min; b) soak for 12 h

圖2 Mg 試樣的極化曲線 Fig.2 Polarization curves of Mg samples: a) soak for 20 min; b) soak for 12 h

表3 Ec 和lgJc 的數值統計 Tab.3 Statistics of Ec and lgJc

2.2 異質金屬作用下高純鎂氫氣釋放的特征

圖3 為各組試樣在PBS 緩沖溶液中浸泡48 h 的氫氣釋放量隨時間的變化趨勢。Mg 在PBS 溶液中浸泡48 h 后，釋放的氫氣總量為23.44 mL，Mg&AZ91為31.61 mL，Mg&TA2 為42.13 mL，Mg&316L 為77.99 mL。由此可見，在48 h 內，四組試樣的氫氣釋放量與電化學腐蝕試驗中的腐蝕速率變化規律一致。在PBS 溶液中浸泡48 h 的過程中，Mg&316L 在24 h左右，氫氣釋放就開始大幅減少，從宏觀腐蝕形貌 （圖4）可以看出，這可能是由于腐蝕速率過快；在腐蝕后期，Mg&316L 中的鎂片已經基本腐蝕完全。

圖3 浸泡48 h 內的析氫曲線 Fig.3 Hydrogen evolution curves during 48 h immersion

各組試樣在PBS 緩沖溶液中浸泡48 h 后，引起溶液中的氫氣溶解濃度隨時間的變化曲線如圖5 所示?？梢园l現，三個測量位置的溶氫量差距較大。異質金屬片表面的溶氫量顯著大于其他兩個位置，主要是因為在電偶電流的極化作用下，很大程度地促進了異質金屬片表面的陰極析氫反應。相對而言，溶液中50 mm 深度處的氫氣溶解濃度更能代表溶液中平均的氫氣溶解量。腐蝕較快的試驗組的氫氣溶解曲線完全處于腐蝕較慢的試驗組上方，且Mg&316L 的峰值為1.315 mg/L，Mg&TA2 的峰值為 0.981 mg/L，Mg&AZ91 的峰值為0.496 mg/L，Mg 的峰值為0.133 mg/L。基本能夠說明，在48 h 過程中，不同試驗組溶液中的氫氣溶解量存在比較顯著的差距，且與異質金屬作用下的腐蝕速率變化規律保持一致。

圖4 浸泡48 h 后各組試樣宏觀腐蝕形貌 Fig. 4 Macroscopic corrosion morphology of each group of samples after immersion for 48 h: a) carrying corrosion products; b) washing away corrosion products

圖5 浸泡48 h 內PBS 溶液中的氫氣溶解濃度 Fig.5 Hydrogen dissolution in PBS solution during 48 h immersion: a) above the surface of dissimilar metals; b) above the surface of Mg; c) 50 mm deep in the solution

2.3 異質金屬作用下高純鎂氫氣釋放的抗腫瘤效應

圖6 為不同氫氣釋放量對甲狀腺腫瘤Cal-62 細胞增殖的試驗結果。從圖中看出，氫氣處理腫瘤細胞24、48、72 h 時，有氫氣釋放的試驗組相比于對照組基本上都具有統計學差異（其中*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.005，****代表p<0.001）。而且，隨著氫氣釋放量及氫氣溶解濃度的升高，這種抑制作用有著增強的趨勢。關于氫氣抗腫瘤的機制研究目前也已經展開，其核心在于氫氣與ROS 的相互作用。由于人腫瘤產生ROS 的速度比正常細胞系快[22]，且ROS 能夠通過多種渠道促進腫瘤微環境中血管的生長，從而加快腫瘤細胞增殖和長大[23]。而氫氣能通過清除ROS，干擾腫瘤細胞呼吸和新陳代謝，保護DNA、RNA 和蛋白質免受過量ROS 氧化，造成損傷，并且還可以抑制腫瘤侵襲和腫瘤血管生成[16,24]。培養48 h 后，需要對腫瘤細胞進行換液處理，導致48 h內溶解在嵌入皿中的氫氣大量損失，使48 h 和72 h的氫氣抑制作用差異不大，遠不及在24 h 和48 h 之間的差異明顯，因此在凋亡試驗和周期試驗中，只進行了48 h 的氫氣釋放。

圖6 氫氣對Cal-62 腫瘤細胞增殖的影響 Fig.6 Effect of hydrogen on the proliferation of Cal-62 tumor cells: a) treat for 24 h; b) treat for 48 h; c) treat for 72 h

圖7 氫氣處理48 h 對Cal-62 腫瘤細胞凋亡的影響 Fig.7 Effect of hydrogen on the apoptosis of Cal-62 tumor cells after treating for 48 h: a) control group; b) Mg group; c) Mg&AZ91 group; d) Mg&TA2 group; e) Mg&316L group; f) statistical chart

圖7 為不同氫氣釋放量對Cal-62 甲狀腺腫瘤細胞凋亡影響的試驗結果。由于本研究采用了AnnexinV- FITC/PI 雙染法，在細胞凋亡的統計圖中，雙陽區（Q2）代表晚期凋亡，FITC 單陽區（Q3）代表早期凋亡， Q2+Q3 之和為統計的細胞凋亡率。從統計結果可以看出，除Mg 組之外，其余有氫氣作用的組的腫瘤細胞凋亡率均與對照組存在顯著差異，氫氣作用明顯促進了細胞凋亡，且隨著氫氣釋放量增加，凋亡率有上升趨勢。對照組凋亡率為5.87%，Mg 組為5.49%，Mg&AZ91 組為10.63%，Mg&TA2 組為24.47%，Mg&316L 組為51.37%。事實上，有研究顯示，氫氣在體內和體外試驗時，激活了結腸癌細胞中一系列的細胞凋亡通路（磷酸化單磷酸腺苷活化蛋白激酶（p-AMPK）、凋亡誘導因子（AIF）和胱天蛋白酶3型（Caspase3）等），促進了腫瘤細胞凋亡[25]。

圖8 為不同氫氣釋放量試驗組對Cal-62 甲狀腺腫瘤細胞周期影響的試驗結果。細胞周期分為DNA合成前期（G0/G1）、DNA 合成期（S）和DNA 合成后期與分裂期（G2/M），各個時期細胞中的DNA 含量具有對應的特征。結果顯示，在氫氣作用后，Cal-62細胞的G2/M 期無顯著變化，但G0/G1 期大幅延長，S 期顯著縮短，即Cal-62 腫瘤細胞被阻滯在G0/G1期，細胞增殖的過程也受到影響。同時，隨著氫氣釋放量增加，對腫瘤細胞周期的阻滯作用也顯現出增強的趨勢。目前，已經存在氫氣對腫瘤細胞周期產生影響的報道，但對于不同細胞，影響的細胞周期時段不同。例如，Saitoh 等[26]發現氫氣和鉑納米膠體聯合治療腫瘤細胞后，G0/G1 期細胞比例下降，G2/M 期細胞增加。但Wang 等[27]的研究表明，氫氣誘導的肺癌腫瘤A549 和H1975 細胞阻滯在G2/M 期，可能的原因是氫氣抑制了一種細胞周期中染色體結合所需的復合物SMC3 的表達。

圖8 氫氣處理48 h 對Cal-62 腫瘤細胞周期的影響 Fig. 8 Effect of hydrogen on the cell cycle of Cal-62 tumor cells after treating for 48 h: a) control group; b) Mg group; c) Mg&AZ91 group; d) Mg&TA2 group; e) Mg&316L group; f) statistical chart

3 結論

1）不同異質金屬對Mg 試樣產生了不同程度的極化作用，引起OCP、Ec和lgJc的升高。排序均為：Mg

2）異質金屬引起腐蝕加速的同時，又加劇了氫氣釋放，各組之間氫氣釋放量存在明顯差異，能夠形成氫氣溶解量差異明顯的溶液，且這種差異與腐蝕加速規律保持一致。

3）增加氫氣釋放量能夠顯著增強氫氣對甲狀腺腫瘤Cal-62 細胞增殖的抑制作用，在氫氣釋放量最多的Mg&316L 組中，抑制率高達55%。這是由于氫氣釋放量增加，腫瘤細胞凋亡率和G0/G1 期的阻滯比例升高共同達成。