醫用鎂合金表面肝素/蒙脫石涂層耐蝕性研究

田景睿，李慧，鄒玉紅，曾榮昌

（山東科技大學 a.化學與生物工程學院 b.材料科學與工程學院，山東 青島266590）

目前，介入性血管支架仍是治療心腦血管缺血性疾病的主要方法之一，醫用金屬材料在其中發揮著舉足輕重的作用。隨著現代醫學和生物材料學的發展，研究重點聚焦于生物可降解支架，其最大的特點在于可降解性，因此，患者需要二次手術將支架取出的問題迎刃而解[1]。近年來，研究最多的生物可降解支架有可降解聚合物支架、可降解鎂合金支架、可降解鐵合金支架和可降解鋅合金支架[2]。聚合物材料的降解行為可通過控制其分子量、單體種類和側枝基團得到調控，如Igaki-Tamai 支架[3]、XINSORB 支架[4]，但是與金屬材料相比，它們都存在支撐力不足、支架壁較厚、對血管有刺激作用等問題，大大限制了其臨床應用[5]。鐵合金作為支架材料表現出良好的機械性能及可視性，但其降解速率過慢的問題[6]，增加了炎癥發生的風險。鋅合金是一種新型生物可降解合金，有研究表明在大鼠試驗中，鋅基支架可表現出令人接受的生物相容性，但會導致慢性和急性炎癥發生，且其在體內外的降解機制和產物代謝吸收等問題仍待進一步研究[7]。鎂合金作為心血管支架材料具有諸多優點，如鎂可參與人體代謝[8]，具有低血栓源性，是ATP酶的輔因子，可抑制血管內再狹窄，維持血管壁張力[9]等。Erbel[10]將71 個可降解鎂合金支架（長10～ 15 mm，直徑3.0～3.5 mm）植入63 例病人的冠狀動脈中，術后血管狹窄率由(61.5±13.1)%降至(12.6±5.6)%。但鎂合金在人體內表現出良好生物相容性的同時，也面臨著降解速度過快的問題[11]。鎂合金植入物降解過快使其機械性能降低，表面粗糙度增加，局部血液pH 值過高[12]，由此引發血栓、血管彈性回縮及血管再狹窄等一系列問題，從而限制了該類支架的應用。目前，表面修飾成為了降低鎂合金腐蝕速率的主要方法，同時為了解決支架植入后的再狹窄等問題，在支架表面攜帶各種藥物成為大勢所趨。Xu 等[13]將負載西羅莫司（一種防止內膜增生的藥物）的絲素蛋白作為AZ31 鎂合金支架涂層的聚合物，研究表明絲素蛋白涂層減緩了藥物從絲素層的釋放，提高了支架的耐腐蝕性能，降低了血管再狹窄的風險。Ye 等[14]篩選了一種普通的口服阿托伐他汀鈣，并將其加載到AZ31 鎂合金表面的聚三亞甲基碳酸酯中，得到了具有降解速率可控、靶向藥物遞送和血管重塑等優點的支架材料。

蒙脫石（又稱蒙脫土）是一種天然的片層狀鋁硅酸鹽黏土礦物，具有良好的陽離子交換能力和吸附性能，可作為黏膜保護劑[15]、抗菌緩釋劑[16]和分散劑[17]等，被廣泛應用于醫療行業。許多臨床醫生[18-20]將蒙脫石用于消化道止血，取得較滿意的臨床療效。王建坤等[21]建立了大鼠肝臟出血模型，研究蒙脫石對肝臟創面的止血作用。結果表明，蒙脫石體外和體內的凝血時間均比空白對照組、殼聚糖止血粉組明顯縮短，具有顯著的促進創面止血功能及良好的生物安全性。筆者所在的課題組在鎂合金表面改性[22-24]、耐蝕性[25-27]、抗菌性[28-29]、生物相容性[30-31]等方面做了許多工作。前期已將MMT 成功制備到鎂合金表面，在此基礎上制備Zn-MMT[32]及MMT/BSA 涂層[33]，結果表明這兩種涂層提高了鎂合金的耐蝕性及生物相容性，Zn-MMT 涂層的抗菌性能優越。

肝素是一種含磺酸基、磺氨基、羧酸基的天然陰離子多糖類化合物，具有抗血栓、抗炎、抗過敏和降血脂等多種功能，是一種理想的抗凝血物質。采用肝素功能化來提高醫用高分子材料的抗凝血性能已經有幾十年的歷史。肝素在體內與抗凝血酶III 、肝素結合蛋白和血小板因子等活性物質結合后發揮抗凝血作用。在血管支架領域，研究人員常常將肝素制備載藥涂層[34-35]，解決支架植入后血管再狹窄的難題，效果顯著。

也有研究人員嘗試將蒙脫石、肝素聯合應用。如陳亞紅等[36]將抗凝血肝素-季胺鹽插層蒙脫土制備成蒙脫土納米抗凝血中間體，然后與硅橡膠復合制備硅橡膠蒙脫土納米抗凝血復合材料，其具有較好的抗凝血性能。Meng 等[37]采用插層法制備了肝素苯扎爾銨改性蒙脫土/聚二甲基硅氧烷膜，抗凝性能明顯優于純聚二甲基硅氧烷膜。但這些研究都局限在抗凝材料方面，將兩者聯合應用在可降解鎂合金支架方面尚未見報道。

肝素是一種天然的具有陰離子特性的凝血抑制劑，具有強抗凝血作用，可將其與具有陽離子表面的材料進行結合，得到肝素化親水性材料。當其與血液接觸時可持續釋放肝素，以防止局部血栓的形成，達 到抗凝血的效果。在金屬表面制備的肝素涂層不僅具有良好的血液相容性，可延緩或阻止血管內支架置入早期形成血栓的過程，而且具有良好的穩定性，有利于維持金屬良好的機械性能[38]。

因此，本試驗在Na-MMT 涂層的基礎上，采用浸泡法，利用正負電荷相互吸引作用，使帶有負電荷的肝素與蒙脫石層間的陽離子形成離子鍵，從而將其固定在蒙脫石內表面得到HS-MMT 抗凝涂層，提高涂層的血液相容性。利用離子鍵將肝素固定在材料表面的結合方式能夠維持肝素的天然構象，因而最大限度地優化了涂層的抗凝效果[36]。本試驗擬采用水熱法在鎂合金表面制備蒙脫石涂層，并采用浸泡法制得肝素/蒙脫石復合涂層以提高其耐蝕性和抗凝血性能，為可降解鎂合金血管支架表面改性提供了一種新方案。

1 試驗

1.1 試劑及儀器

試劑包括：鈉化蒙脫石（藥品級）購于浙江豐弘有限公司；肝素鈉（生物試劑）購于上海源葉生物科技有限公司；DMEM 培養基（生物級）購于青島捷世康生物科技有限公司；氯化鈉等化學試劑均為分析純，購于天津市凱通化學試劑有限公司。

主要儀器包括：pH 計，STARTER 2100 型，奧豪斯儀器有限公司；電子天平，XY600-2C，常州市幸運電子設備有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101Z，鞏義市予華儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，DHG-9023A，上海精宏試驗設備有限公司。

1.2 復合涂層的制備

1.2.1 AZ31 鎂合金表面處理

采用規格為15 mm×15 mm×4 mm 和20 mm× 20 mm×4 mm 的擠壓態AZ31 鎂合金為研究對象，用360#、600#、800#、1000#水磨砂紙對樣品進行打磨，以去除表面氧化層，用丙酮清除表面油污，乙醇清洗，吹干備用。

1.2.2 涂層的制備

稱取鈉化蒙脫石（Na-MMT）溶于去離子水中，制成 Na-MMT 質量分數為 2%的懸浮液，調節pH=10.2，80 ℃下恒溫攪拌5 h 后取60 mL 加入水熱釜中。將處理好的AZ31 鎂合金置于水熱釜中保持直立（放入2 塊聚四氟乙烯支撐），將其置于130 ℃恒溫干燥箱中，36 h 后取出，去離子水清洗，吹干得Na-MMT 涂層。將其浸泡于2.5 g/L 肝素鈉溶液（PBS緩沖溶液配成）中，調節pH=7.4，30 min 后取出，用去離子水清洗，吹干得肝素/蒙脫石（HS-MMT）復合涂層，制備流程見圖1。

圖1 HS-MMT 涂層制備流程圖 Fig.1 Schematic illustration of preparation of HS-MMT coating

1.3 HS-MMT 涂層的表征及性能檢測

1.3.1 涂層的表征

采用掃描電子顯微鏡（Nova Nano SEM 450，USA）觀察涂層表面、截面形貌及涂層厚度，利用能譜儀（EDS）分析樣品組成元素。通過傅里葉紅外分析儀（NicoletiS50）測定涂層官能團。采用X-衍射儀（D/MAX-2500PC）表征物相組成。

1.3.2 涂層的耐蝕性測試

1）電化學測試。采用三電極體系，參比電極為飽和甘汞電極（SCE），對電極為鉑電極，工作電極為被測樣品，腐蝕介質DMEM 溶液的pH 值為7.4，試驗溫度為室溫，測試樣品面積與測試溶液體積比為1 cm2/400 mL。動態極化測試時，電位掃描范圍相對自腐蝕電位從–350 mV（vs. SCE）到+450 mV（vs. SCE），掃描速度為1 mV/s。

2）析氫試驗。用酸式滴定管、玻璃漏斗和燒杯自制析氫裝置。按1 cm2/25 mL的面積/溶液比將AZ31鎂合金基體和HS-MMT 涂層分別懸浮于DMEM 溶液中，每組3 個平行樣。將樣品浸泡5 d，每24 h 更新液體，溶液溫度保持在(36.5±1) ℃。每1 h 測定1 次樣品在腐蝕過程中產生的氫氣體積。

2 結果與討論

2.1 形貌觀察及成分分析

Na-MMT、HS-MMT 涂層電鏡形貌及EDS 分析見圖2。可以看出，低倍鏡下Na-MMT 涂層呈顆粒狀結構，HS-MMT 涂層除顆粒狀外還可觀察到片層狀結構，未見基體。與Na-MMT 涂層相比，HS-MMT涂層略為致密。從圖2b、2e 中可以看出，高倍鏡下兩種涂層均呈典型的蒙脫石片層狀結構，此外圖2b、2e 中截面圖顯示 Na-MMT 涂層厚度為 40 μm，HS-MMT 涂層厚度為41 μm。以上結果表明，水熱法成功在AZ31 鎂合金表面制備了Na-MMT 涂層和HS-MMT 涂層，且涂層制備過程未對蒙脫石的結構產生影響，保留了蒙脫石的性質。圖2c、2f 分別是Na-MMT 和HS-MMT 的EDS 元素分析，兩圖對比可知，HS-MMT 涂層中除存在O、Na、Mg、Al、Si、C 等Na-MMT 涂層的基本元素外還出現了N、S 元素，說明通過浸泡法Na-MMT 涂層成功吸附了HS，在AZ31 鎂合金表面制備了HS-MMT 涂層[21]。

圖2 Na-MMT 和HS-MMT 涂層電鏡下形貌及EDS 元素分析 Fig.2 SEM morphology and EDS of Na-MMT coating and HS-MMT coating

圖3 HS-MMT 涂層的XRD 譜圖 Fig.3 XRD patterns of HS-MMT coating

HS-MMT 涂層的XRD 譜圖如圖3 所示。從圖3中可以看出，HS-MMT 涂層與Na-MMT 涂層的圖譜 相似，都具有蒙脫石的特征峰，但由于肝素為有機物，XRD 測試無法顯示其特征峰。此外，HS-MMT 涂層與Na-MMT 涂層圖譜中還出現了Mg、Mg(OH)2的特征峰，說明水熱法成功地將Na-MMT 應用于AZ31鎂合金表面并形成涂層[33]。

HS-MMT 涂層的FTIR 譜圖如圖4 所示。圖4 中顯示HS-MMT 涂層、Na-MMT 與Na-MMT 涂層在1038、1643、3627 cm–1處都出現了蒙脫石特有的吸收帶，分別對應于Si—O 伸縮振動、H—O—H 伸縮振動和表面吸附水、層間水及氧化鎂引起的Al—O—H基團的伸縮振動。此外，HS-MMT 涂層與Na-MMT涂層在694 cm–1處還出現了Si—O—Mg 的伸縮振動峰，這說明在AZ31 鎂合金表面成功制備了涂層[21,33,36]。與Na-MMT、Na-MMT 涂層相比，HS-MMT 涂層在620 cm–1處出現了肝素特有的—SO3H 伸縮振動峰[39]，在1235 cm–1和3417 cm–1處出現了肝素分子中S==O和—NH—的伸縮振動峰[38,40]，這證明在HS-MMT 涂層中存在肝素。

圖4 HS-MMT 涂層的FTIR 譜圖 Fig.4 FTIR spectrum of HS-MMT coating

2.2 耐蝕性能

所得涂層樣品的EIS 表征如圖5 所示。樣品的容抗弧直徑越大，說明其耐蝕性能越好。Nyquist 圖顯示樣品的耐腐蝕性能依次為HS-MMT 涂層>Na-MMT涂層>AZ31 鎂合金，這表明HS-MMT 涂層能有效減緩AZ31 鎂合金在DMEM 溶液中的腐蝕，提高了其耐腐蝕能力。所得涂層樣品的極化曲線如圖6 所示，經Tafel 外推法得到的涂層的自腐蝕電位（Ecorr）和腐蝕電流密度（Jcorr）見表1。由結果可知，在極化過程中，AZ31 鎂合金的Ecorr最小、Jcorr最大，與其相比，Na-MMT 涂層的 Ecorr增大、Jcorr減小，而HS-MMT 涂層的Ecorr最大、Jcorr最小，這說明HS-MMT涂層具有更好的耐腐蝕性能，與Nyquist 曲線結果一致[41]。

圖5 鎂合金基體、Na-MMT 和HS-MMT 涂層的Nyquist曲線 Fig.5 Nyquist plots of the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

所得涂層樣品的析氫速率曲線如圖7 所示，從圖7 中可以看出，浸泡初期AZ31 鎂合金的析氫速率較 大且下降速度較快，大約30 h 后析氫速率降低到較低水平，下降速度也變得緩慢。這可能是由于Cl 離子等腐蝕性離子的腐蝕作用導致AZ31 鎂合金在浸泡初期的析氫速率較快，然后由于腐蝕產物Mg(OH)2對AZ31 鎂合金產生保護作用[40,42-43]，腐蝕速率大大降低。由圖7 可知，Na-MMT 涂層與HS-MMT 涂層的析氫速率變化不大，平均析氫速率分別為0.024、0.016 mL/(cm·h)，說明兩種涂層對AZ31 鎂合金起到了保護作用，而HS-MMT 涂層的保護作用更明顯，這除了與涂層的物理隔離作用有關外[44]，還可能與帶負電荷肝素的持續析出有關。

圖6 鎂合金基體、Na-MMT 和HS-MMT 涂層的極化曲線 Fig.6 Polarization curves of the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

表1 極化曲線的電化學參數 Tab.1 Electrochemical parameters of the polarization curve

圖7 鎂合金基體、Na-MMT 和HS-MMT 涂層析氫速率 Fig.7 Hydrogen evolution rates as a function of time for the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

進一步分析Na-MMT 涂層的形成機理：在堿性條件下，Na-MMT 發生水化反應后，其硅氧四面體表面具有的活性OH–可與鎂合金水化反應產生的OH–在水熱條件下脫去H2O，形成氧橋，使Na-MMT 與AZ31 鎂合金緊密結合，形成Na-MMT 涂層，如圖8所示。Na-MMT 與AZ31 鎂合金可能發生的化學反應見式(1)—(4)。

蒙脫石發生水化反應：

蒙脫石與NaOH 的反應：

鎂合金發生水化反應：

蒙脫石與Mg(OH)2反應：

圖8 Na-MMT 涂層制備機理示意圖 Fig.8 Schematic illustration of Na-MMT coated Mg alloy AZ31

3 結論

1）采用水熱法在AZ31 鎂合金表面制備了Na- MMT 涂層，在此基礎上通過浸泡法成功制備了致密的HS-MMT 復合涂層。

2）通過電化學試驗和析氫速率測定對HS-MMT涂層的耐蝕性能進行研究。結果顯示，HS-MMT 涂層的自腐蝕電位（–1.20 V）高于 AZ31 鎂合金（–1.49 V），腐蝕電流密度降低了2 個數量級，且其平均析氫速率為0.016 mL/(cm·h)，明顯低于AZ31 鎂合金的平均析氫速率。這表明AZ31 鎂合金HS-MMT涂層具有良好的耐腐蝕性能。