不飽和脂肪酸對人脂肪間充質干細胞生物學特性的影響

李錦靈，林立龍，李治寰

(東莞市恩聯干細胞生物科技研究院，中國廣東東莞523000)

人脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是存在于脂肪組織中的一種多潛能干細胞，在特定條件下可誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等多種細胞[1]。ADSCs免疫原性低，可減少同種異體間移植的排斥，且具有旁分泌功能，可分泌多種生長因子及炎性因子[2]，在修復、替換、維持或增強組織和器官功能等研究領域顯示出強大的再生醫學功能，因此被廣泛應用于臨床研究[3]。據中國醫藥生物技術協會網站提供的信息(http://www.cmba.org.cn/common/index.aspxnodeid=281&pagesize=1&pagenum=10.htm)，截至2020年11月，在國家衛生健康委員會備案的干細胞臨床研究機構已增至111家，備案項目達100個，其中有5個臨床研究項目使用的細胞為ADSCs，包括廣東省中醫院開展的ADSCs治療中重度尋常型銀屑病的試驗；上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院開展的異體ADSCs治療膝骨關節炎的臨床研究；聊城市人民醫院開展的ADSCs治療中重度潰瘍性結腸炎及肺動脈高壓的臨床研究等。國內外多項ADSCs相關動物及臨床研究證實，ADSCs具有應用于糖尿病足[4]、心肌缺血[5]、腦損傷[6]等修復治療的潛力。

脂肪酸是生物體的供能物質和生物膜的重要組成部分，是膳食中重要的能量來源物質。脂肪酸根據飽和程度的不同可分為飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)，其中不飽和脂肪酸又分為單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)及多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)[7]。不飽和脂肪酸及其代謝產物是細胞結構和功能的重要組成部分，在干細胞命運調控方面具備特定的功能。2014年Kang等[8]在Stem Cells上發表的綜述中提到，Ω-6和Ω-3族PUFA及其代謝產物與細胞結構及功能有關，它們可以通過多種作用機制，影響不同來源間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的生物學特性，例如促進多種干細胞的增殖及分化，繼而影響干細胞的命運調控。目前，關于PUFA在干細胞分化中的作用研究主要集中在PUFA來源的代謝產物，包括花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)、白三烯 B4(leukotriene B4，LTB4)、血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)，而研究的細胞模型多以神經干細胞為主，對MSCs的研究較少[8～9]。只有少量研究涉及DHA、EPA和AA等對人臍帶、骨髓來源MSCs增殖或分化方面的影響[10～11]。三系分化能力是鑒定MSCs的標準之一，已有研究表明脂肪酸能影響體外培養的成肌干細胞的分化[12]，但目前尚未有研究報道脂肪酸對ADSCs三系分化能力的影響。本研究旨在體外分離、培養ADSCs，并應用不飽和脂肪酸作用于ADSCs，探究MUFA中的油酸和PUFA中的亞麻酸對ADSCs形態、增殖、免疫表型及分化潛能的影響，為ADSCs提供更優化的培養體系，為脂肪酸應用于MSCs提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

脂肪組織取自東莞市第五人民醫院的志愿者，使用含2%青鏈霉素混合液的生理鹽水保存。

杜氏磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco′s phosphatebuffered saline，DPBS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、α-MEM(MEM alpha basic)培養基、0.125%胰酶(Gibco公司，美國)；人血小板裂解液(Helios公司，美國)；Ⅷ型膠原酶(Sigma公司，美國)；油酸(＞85.0%，SG)、亞麻酸(＞70.0%，SG)(梯希愛化成工業發展有限公司)；MSC成脂誘導分化試劑盒、MSC成骨誘導分化試劑盒、MSC軟骨誘導分化試劑盒、阿利新藍、油紅O、茜素紅(賽業生物科技有限公司)；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；流式單抗PE mouse IgG1 κ isotype control(PE-ISO，同型對照)、PE mouse anti-human CD13、PE mouse anti-human CD29、PE mouse anti-human CD44、PE mouse anti-human CD73、PE mouse anti-human CD90、PE mouse antihuman CD105、PE mouse anti-human CD31、PE mouse anti-human CD45(BD 公司，美國)；TriQuick Reagent(北京索萊寶科技有限公司)；QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN公司，德國)；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司，日本)；ultrapure distilled water(Invitrogen 公司，美國)；BIOG血清血漿游離RNA提取試劑盒(常州百代生物科技股份有限公司)。

1.2 ADSCs的分離、培養與傳代

取志愿者皮下脂肪組織，使用含2%青鏈霉素混合液的生理鹽水與脂肪組織充分混勻，400g離心7 min后倒出脂肪組織，重復數次上述洗滌步驟，直至無明顯血液殘留。按照1︰1體積比加入0.15%Ⅷ型膠原酶溶液，充分混勻后置于37℃水浴鍋中消化30 min，期間每隔5 min混勻一次。消化完成后400g離心7 min，棄上層脂肪，細胞沉淀重懸于含1%青鏈霉素混合液和5%人血小板裂解液的α-MEM培養基中。將細胞懸液用100 μm細胞濾網過濾后接種于T-175培養瓶，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，培養72 h后更換不含青鏈霉素混合液的培養基并除去未貼壁細胞，之后每隔3 d換液，細胞融合度達80%后用0.125%胰酶消化2～3 min，加入3倍體積的生理鹽水稀釋消化，以1︰3比例傳代，取第3～5代的細胞進行誘導增殖。

1.3 油酸或亞麻酸誘導ADSCs增殖的最佳濃度篩選

油酸、亞麻酸分別使用含5%人血小板裂解液的 α-MEM 培養基稀釋成 20 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L 的濃度梯度。將P5代ADSCs以每孔5×104個細胞的密度接種于6孔板，細胞過夜貼壁后將培養基換成2 mL含不同濃度脂肪酸的培養基，以不加脂肪酸的培養基為空白對照組，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中繼續培養48 h，吸棄舊培養液并用生理鹽水清洗，隨后用0.125%胰酶消化細胞，終止消化后，制備單細胞懸液。使用Counstar IM 1200自動細胞計數儀(上海睿鈺生物科技有限公司)檢測細胞數量及細胞活率。

為優選最佳的使用濃度，首先設置大范圍的濃度梯度，得出合適的濃度范圍，再設置小范圍的濃度梯度來測定具體的數值。因此，將油酸、亞麻酸使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培養基繼續稀釋成 10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L 的濃度梯度。將 P4 代 ADSCs以每孔2×104個細胞的密度接種于6孔板，細胞過夜貼壁后將培養基換成2 mL含不同濃度脂肪酸的培養基，以不加脂肪酸的培養基為空白對照組，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中繼續培養72 h，吸棄舊培養液并用生理鹽水清洗，隨后用0.125%胰酶消化細胞，終止消化后制備單細胞懸液并進行計數，比較各組的細胞數量及細胞活率。

1.4 油酸或亞麻酸對ADSCs形態的影響及生長曲線繪制

取5×104個ADSCs(P3代)接種于10 cm的培養皿中，細胞過夜貼壁后將培養基換成10 mL含20 μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養基(含5%人血小板裂解液的α-MEM培養基)，以不加脂肪酸為空白對照組，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。每隔24 h在各組中隨機選擇3個培養皿，吸棄舊培養液并用生理鹽水清洗1次，吸棄生理鹽水后再加1 mL的0.125%胰酶消化細胞，終止消化后，制備單細胞懸液，吹打混勻，取20 μL細胞懸液與20 μL 0.2%臺盼藍溶液混勻后加樣到細胞計數板上，使用細胞計數儀檢測細胞數量及細胞活率(每孔取3個視野計數后取平均值進行統計分析)，以時間為橫軸，總細胞個數為縱軸繪制細胞生長曲線。各組細胞培養48 h后，在顯微鏡下觀察并記錄其形態是否有差異。

1.5 流式細胞術檢測細胞免疫表型

取P3代細胞以4 500 cm-2的密度接種于T-175培養瓶，細胞過夜貼壁后將培養基換成含20 μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養基繼續培養，以不加脂肪酸為空白對照組，細胞融合度達90%后，取各組細胞進行流式細胞術分析。流式細胞術檢測的具體步驟如下:收集各組ADSCs并使用1 mL PBS重懸細胞后計數，將1 mL細胞懸液均分至11個EP管中，每個EP管中的細胞數量為2.2×105個，3 000 r/min 離心 6 min，小心棄上清后再加入25 μL的PBS重懸細胞沉淀，將流式單抗PE-ISO(同型對照)及 CD13、CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 對應的抗體各取 5 μL加入相應的EP管中，陰性對照組加入5 μL的DPBS(未染色的細胞即為陰性對照)，混勻后4℃冰箱避光孵育30 min。孵育終止后，每管加入500 μL的PBS洗滌樣品，3 000 r/min離心6 min，小心棄上清。洗滌兩次后加入200 μL的PBS重懸，將細胞懸液轉移到流式管中，采用流式細胞術分析細胞表面抗原的表達情況。

1.6 細胞三系分化能力檢測

取P3代的ADSCs細胞以4 500 cm-2的密度接種于T-175培養瓶，細胞過夜貼壁后將培養基換成含20 μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養基繼續培養，以不加脂肪酸為空白對照組，細胞融合度達90%后，取各組細胞進行成脂、成骨、成軟骨誘導培養并染色鑒定。

成脂分化能力檢測:取4.5×105個ADSCs接種到裝有2 mL MSC培養基的6孔板中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞融合度達到90%時，換成2 mL MSC成脂分化培養基A液[含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛]；3 d后更換為2 mL培養基B液(含胰島素及10% FBS)；24 h后再更換成A液誘導，循環誘導7 d后使用油紅O染液進行染色鑒定。

成骨分化能力檢測:取4.5×105個ADSCs接種到裝有1 mL MSC培養基的12孔板中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞長到基本融合時，更換1 mL MSC成骨分化培養基，每隔2 d更換一次MSC成骨分化培養基，培養14 d后使用茜素紅進行染色鑒定。

成軟骨分化能力檢測:收集各組細胞并制備成單細胞懸液，計數后取出含有1.0×106個ADSCs的細胞懸液，1 200 r/min離心獲得細胞沉淀，吸棄上清后加入10 μL MSC培養基重懸細胞沉淀，取5 μL細胞沉淀置于24孔板，以形成細胞微團。將細胞置于培養箱中培養，2 h后向24孔板中加入1 mL MSC成軟骨誘導分化培養基，每隔2 d換一次MSC成軟骨誘導分化培養基，培養14 d后使用阿利新藍染液進行染色鑒定。

1.7 Q-PCR檢測成骨、成軟骨及成脂分化相關標志基因的表達水平

取P3代細胞以4 500 cm-2的密度接種于T-175培養瓶，細胞過夜貼壁后將培養基換成含20 μmol/L油酸或亞麻酸的培養基繼續培養。細胞融合度達90%后，取1×106個細胞接種到裝有2 mL完全培養基的6孔板中，每組重復2個孔，培養24 h后更換特定的誘導培養基進行成脂、成骨、成軟骨誘導培養。誘導9 d后根據QIAzol Lysis Reagent說明書分別提取各組ADSCs的總RNA，并用微量分光光度儀檢測RNA的濃度和純度，隨后根據逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA作為模板，以GAPDH為內參，采用Q-PCR檢測成脂標志基因PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ)、成軟骨標志基因SOX9(SRY-related protein 9)和COL2A1(typeⅡ collagen-A1)以及成骨標志基因ALP(alkaline phosphatase)、OCN(osteocalcin)、RUNX2(runt-related transcription factor 2)的mRNA表達水平。上下游引物均是根據NCBI提供的mRNA序列，使用Primer 3 Plus軟件設計，由上海生工生物工程股份有限公司最終合成。PCR引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度的油酸或亞麻酸對ADSCs增殖的影響

為了得出油酸或亞麻酸誘導ADSCs增殖的最佳濃度，我們開展了濃度梯度實驗。首先，設置油酸或亞麻酸的濃度梯度為 20 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L，結果如圖 1所示。當油酸或亞麻酸濃度為20 μmol/L時，總細胞個數與對照組相比明顯升高(P＜0.05)，細胞活率無顯著變化(P＞0.05)；當濃度達到 40 μmol/L 時，總細胞個數有降低的趨勢，而當濃度達到100 μmol/L時，細胞活率明顯降低(P＜0.05)(圖 1A～D)。從上述實驗結果可初步得出，油酸或亞麻酸的適用濃度應低于40 μmol/L。因此，我們進一步開展了小范圍的濃度梯度實驗，設置油酸或亞麻酸的濃度梯度為 10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L。結果顯示:與對照組相比，當油酸或亞麻酸濃度達到20 μmol/L時，總細胞個數有明顯的上升(P＜0.01)(圖 1E，G)，而當濃度達到 25 μmol/L時，細胞的活率出現下降的趨勢(圖1F)。綜上可知，油酸或亞麻酸誘導ADSCs增殖的最佳濃度為20 μmol/L。

圖1 不同濃度的油酸或亞麻酸對ADSCs增殖的影響與空白對照組比較:*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Fig.1 Effects of different concentrations of oleic acid or linolenic acid on proliferation of ADSCs*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared with the control group.

2.2 油酸或亞麻酸對ADSCs生長曲線及細胞形態的影響

通過濃度梯度實驗結果得出油酸或亞麻酸誘導ADSCs增殖的最佳濃度為20 μmol/L。因此，我們繪制了20 μmol/L油酸或亞麻酸培養的ADSCs的生長曲線，并通過重復實驗驗證油酸或亞麻酸是否能促進ADSCs增殖。從圖2A可知，與對照組相比，20 μmol/L 亞麻酸培養 48 h、20 μmol/L油酸培養72 h后ADSCs數量顯著增加(P＜0.05)，而培養96 h后各組細胞進入生長平臺期，且總的細胞數量基本一致。從統計數量來看，與對照組相比，細胞在添加了脂肪酸的培養體系培養72 h后，其數量增加了20%左右。另外，從圖2B可知，油酸或亞麻酸組在各培養時間點細胞的活率與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，且都大于95%。使用油酸或亞麻酸培養48 h后的細胞形態如圖3所示，細胞長梭形，較均一，呈旋渦狀或編織狀排列，各組細胞的形態無明顯差異。以上實驗結果表明，油酸或亞麻酸能夠促進ADSCs增殖，且不會引起細胞形態發生改變。

圖2 油酸或亞麻酸培養ADSCs的生長曲線(A)及細胞活率(B)亞麻酸組與空白對照組比較:*P＜0.05；油酸組與空白對照組比較:#P＜0.05。Fig.2 The growth curve(A)and cell viability(B)of ADSCs cultured with oleic acid or linolenic acid*P＜0.05，the linolenic acid group compared with the control group；#P＜0.05，the oleic acid group compared with control group.

圖3 油酸或亞麻酸培養48 h后ADSCs的形態(40×)Fig.3 The morphology of ADSCs cultured with oleic acid or linolenic acid for 48 hours(40×)

2.3 油酸或亞麻酸培養后ADSCs表面標志物的表達情況

油酸、亞麻酸能促進ADSCs增殖，為驗證它們是否會影響ADSCs的干細胞特性，我們對其培養后的ADSCs進行了表面抗原檢測。結果表明，20 μmol/L油酸或亞麻酸培養的ADSCs均表達CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，不表達或低表達CD31及CD45，細胞表型和不添加脂肪酸的空白對照組無差異(表2、圖4)。

圖4 不同實驗組的流式細胞術分析結果(A)同型對照及陰性對照；(B)空白對照組；(C)油酸組；(D)亞麻酸組。Fig.4 The results of flow cytometry analysis in different experimental groups(A)The isotype control and negative control；(B)The control group；(C)The oleic acid group；(D)The linolenic acid group.

表2 油酸或亞麻酸培養后ADSCs表面標志物的表達情況Table 2 Expression of surface markers on ADSCs cultured with oleic acid or linolenic acid

2.4 油酸或亞麻酸培養后ADSCs的三系分化能力及分化相關基因的表達

為了進一步驗證油酸或亞麻酸培養是否對細胞的分化能力產生影響，我們對各組細胞進行了成軟骨、成骨及成脂誘導和染色鑒定(圖5)，并從分子水平檢測了三系分化誘導培養9 d后相關標志基因的mRNA表達水平。ADSCs在成軟骨誘導體系中誘導14 d后，細胞團逐步形成一個密實且有彈性的乳白色小球，阿利新藍染色結果顯示軟骨細胞團呈藍色。與對照組相比，油酸組及亞麻酸組誘導形成的軟骨細胞團體積較大，形態較完整。Q-PCR檢測結果顯示，油酸組及亞麻酸組的成軟骨標志基因SOX9和COL2A1的mRNA表達水平較對照組顯著增高(P＜0.05，圖6A～B)。細胞在成骨誘導液中誘導14 d后，茜素紅染色可見密集的細胞間散在大量的染為橘紅色的礦化結節，說明誘導后細胞周圍有明顯鈣沉積。其中，亞麻酸組生成的礦化結節稠密且染色最深，油酸組次之，而對照組生成的礦化結節面積較小且分散。Q-PCR檢測結果顯示，油酸組或亞麻酸組的成骨標志基因ALP、OCN及RUNX2的mRNA表達水平較對照組顯著增高(P＜0.05，圖6C～E)。細胞經成脂誘導7 d后進行油紅O染色，顯微鏡下可見細胞內脂滴呈鮮紅色且邊界清晰。在油酸或亞麻酸增殖培養后的ADSCs內脂滴的大小和數量均呈現增加的趨勢，且成脂標志基因PPAR-γ的mRNA表達水平較對照組有顯著增加(P＜0.01，圖6F)。實驗結果表明油酸或亞麻酸能促進ADSCs的三系分化能力。此外，從表3的數據可得出，與成軟骨及成脂相關基因的表達水平相比，油酸或亞麻酸對ADSCs成骨分化能力的促進更為顯著。

表3 各組ADSCs三系誘導分化相關基因的mRNA表達數據Table 3 The mRNA expression data of multilineage differentiation of ADSCs in each group

圖5 各組ADSCs的成軟骨分化(40×)、成骨分化(40×)和成脂分化(200×)效果Fig.5 Chondrogenesis(40×)，osteogenesis(40×)，and adipogenesis(200×)of ADSCs in each group

圖6 各組ADSCs三系誘導分化相關基因的mRNA表達水平與空白對照組比較:*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Fig.6 The mRNA expression levels of multilineage differentiation of ADSCs in each group*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared with the control group.

3 討論

MSCs是一種多能成體干細胞，存在于胎盤、臍帶、骨髓和脂肪等多種組織中，具有一定的分化潛能，可分泌多種利于組織重塑和免疫調節的細胞因子，這些特性使得MSCs成為治療各種先天性和后天性疾病的出色候選者[14]。脂肪來源的MSCs具有來源豐富、取材方便、回植體內無需配型、免疫原性低、無腫瘤化傾向、可避免倫理法律問題等優點，在臨床研究方面使用廣泛[1]。國內臨床研究顯示，18名骨關節炎患者接受了不同劑量的自體脂肪來源的MSCs注射，96周的隨訪結果表明，關節內注射ADSCs可以改善患者膝關節的疼痛、功能和軟骨體積[15]。另有研究表明，ADSCs移植可減輕炎癥反應、促進血管新生、促進肉芽組織形成以及加速上皮化形成等，從而促進糖尿病足潰瘍創面愈合[16]。在醫療美容領域，有研究表明ADSCs可用于豐胸豐唇、促進皮膚再生和傷口愈合、治療脫發等[17～18]。臨床試驗和組織再生工程需要大量具有生物學活性的ADSCs，但是脂肪供體可以提供的脂肪樣本量有限，且細胞在體外擴增培養的時間也有上限。為更好地滿足臨床需求，有必要在不降低細胞生物學活性的前提下，提高單位時間內收獲的ADSCs的數量和質量。為實現這一目的，我們在細胞分離技術、培養基成分和培養條件等多方面進行技術攻關，提高ADSCs從組織中的分離效率以及在培養過程中的擴增效率。

ADSCs分離方法主要包括組織塊貼壁法、膠原酶消化法、機械分離法、膠原酶結合組織塊貼壁法和懸浮培養法等，其中主流的分離方法是組織塊貼壁法和膠原酶消化法[19]。Ⅷ型膠原酶來源于溶組織梭菌，可產生粗膠原酶，具有梭菌蛋白酶、非特異性中性蛋白酶和胰蛋白酶活性，經測試適合脂肪細胞的消化和解離[20]。本研究采用0.15%Ⅷ型膠原酶對脂肪組織進行消化，結果顯示該分離方法可獲得形態均一的ADSCs。目前，MSCs的體外培養擴增體系常用基礎培養基添加一定濃度的FBS，但FBS可能攜帶某些未確診的動物傳染病病毒或者含有致病性的朊病毒蛋白質以及針對胎牛抗原的異種蛋白質，在培養過程中動物源的蛋白質或肽段可能會污染MSCs，從而使其輸入人體后發生免疫排斥反應[21]。研究發現，人血小板裂解液可以在體外擴增培養MSCs，且并不會引起MSCs生物學特性的改變[22]。另外，人血小板裂解液來源于人類，臨床應用安全性高，故可作為FBS合適而安全的替代品。本研究使用0.15%Ⅷ型膠原酶進行組織消化后，使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培養基作為基礎培養體系。在此基礎上，我們創新性地提出了在培養體系中加入一定濃度的油酸或亞麻酸。亞麻酸是Ω-3族PUFA中EPA及DHA的合成前體，其可能通過環氧化酶(cyclooxygenase-2，COX-2)代謝通路，產生代謝產物前列腺素(prostaglandin，PG)，進而促進多種干細胞的增殖[8]。另外，有研究報道在20～60 μmol/L濃度范圍內，反油酸和反異油酸能夠顯著促進ADSCs的成脂分化，其作用呈現劑量效應關系，其機制可能與Wnt/β-catenin信號轉導通路有關[23]。

本研究將ADSCs使用20 μmol/L油酸或亞麻酸培養72 h后，與空白對照組相比，細胞數量增加了20%左右(圖2A)，所獲得的ADSCs高表達CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，低表達CD31、CD45，和不添加脂肪酸的培養基獲得的ASDCs無顯著差異(表2、圖4)。在促進細胞增殖的同時，我們的培養方法也提高了細胞三系分化潛能(圖5)，與成軟骨及成脂相關基因的表達水平相比，油酸或亞麻酸對成骨分化的影響更為顯著(圖6C～E)。另外，本研究發現，油酸或亞麻酸的濃度大于100 μmol/L時會產生細胞毒性，細胞出現凋亡(圖 1A～D)；而在 20～40 μmol/L 有效濃度范圍內可促進ADSCs的增殖(圖1E～F)，且不會影響其干細胞特性。因此，低濃度的油酸或亞麻酸可考慮用作添加劑制備促進ADSCs增殖的培養基，在提高細胞增殖率的同時，又能提高細胞的分化潛能，從而快速獲得更多穩定可靠的ADSCs，以用于各種基礎研究及疾病治療的臨床試驗。需要指出的是，油酸及亞麻酸促進ADSCs增殖及分化的機制仍需進一步的研究，且作為添加劑加入培養基中時，培養所得ADSCs的安全性有待進一步驗證。