丹參治療糖尿病神經病變分子機制及其歸經實質探討*

鐘達源，李蘭，蔣成婷，鄧奕輝

湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

糖尿病為慢性系統性疾病，全球發病率高達6.7%[1]，糖尿病神經病變是糖尿病最常見的長期并發癥之一，在糖尿病患者中發病率為15%[2]，其中以糖尿病神經病理性疼痛最為常見，而糖尿病周圍神經病變患者大概率會出現慢性疼痛[3]。雖然目前已開發出許多藥物用于治療糖尿病神經病變，但在不良反應和長期療效方面仍表現不佳[4]，因此，有必要尋找新的更好的治療方法。最新證據表明，從生物心理社會的角度來看，天然保健品和膳食可能是糖尿病神經病變新的獲益來源[5]，中藥及復方含有大量的化學成分，可作用于疾病相關的多個靶點，對于糖尿病神經病變這種多因素、復雜性疾病的治療具有優勢。

糖尿病神經病變屬于現代醫學病名，根據癥狀可將其歸屬于中醫的“消渴”“血痹”等范疇，病機主要包括陰陽氣血虧虛和痰瘀內積兩個方面。段力等[6]通過文獻研究發現，2型糖尿病周圍神經病變是本虛標實、虛實夾雜之病，本虛以氣虛、陰虛為主，標實以血瘀為主。丹參是雙子葉唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血化瘀的功效，對證治療糖尿病神經病變血瘀證有確切療效。文獻研究揭示了丹參在臨床試驗中改善血脂的臨床效果[7]。有證據表明，丹參的生物活性成分可以改善小鼠的認知缺陷，保護神經細胞，防止淀粉樣蛋白β纖維的形成和解聚[8]。丹參提取物可顯著改善脊髓損傷后組織病理學改變，促進運動功能恢復[9]。越來越多的證據表明，丹參可以通過調節Wnt、Akt、PI3K、NOS、AGEs等多條通路，改善氧化還原穩態，抑制細胞凋亡和炎癥，從而展現其抗糖尿病活性[10-13]。可見丹參在治療糖尿病神經病變方面療效確切，具有廣闊的應用前景。目前，針對丹參治療糖尿病神經病變的研究逐漸深入，但尚無針對其具體分子作用機制的研究，且丹參治療糖尿病神經病變是否與歸經相關無從得知。因此，為了指導丹參治療糖尿病神經病變的研究方向且探明丹參歸經實質，本文采用網絡藥理學研究方法對丹參治療糖尿病神經病變的分子靶點及通路進行預測，并對丹參歸經實質進行探討。

1 資料與方法

1.1 文獻來源TCMSP數據庫，PubChem數據庫，PharmMapper數據庫，CTD數據庫，BioGPS數據庫。

1.2 丹參有效成分的收集及處理通過TCMSP數據庫檢索并篩選丹參的有效成分。通過PubChem數據庫查找化合物的3D結構并將其導入PharmMapper數據庫以預測其分子對接靶點。將丹參靶點名注釋后通過string數據庫構建PPI網絡。通過CTD數據庫檢索糖尿病神經病變疾病靶點18 044個，將PPI網絡中包含的靶點與糖尿病神經病變疾病靶點相交取共同子集，即得到丹參治療糖尿病神經病變的靶點。

1.3 丹參靶點在心肝胰肺腎的蛋白表達網絡通過BioGPS數據庫檢索PPI網絡中包含的基因在心肝胰肺腎的表達情況，并篩選表達最高的器官。采用丹參治療糖尿病神經病變靶點、丹參靶點及丹參在心肝胰肺腎的最高表達分布數據，構建丹參靶點在心肝胰肺腎的蛋白表達網絡，并通過cytoscape軟件進行可視化。

1.4 丹參治療糖尿病神經病變靶點網絡構建將丹參相關靶點間相互關系、化合物與靶點相互關系文件整理后導入Cytoscape 3.6.1軟件構建丹參靶點網絡圖。通過Network Analysis功能，以degree>30篩選出丹參的關鍵靶點。

1.5 丹參化學成分治療糖尿病神經病變關鍵靶點的GO及KEGG通路分析將丹參治療糖尿病神經病變關鍵靶點通過R軟件的clusterProfiler[14]程序包進行GO及KEGG富集分析，篩選有關通路，剔除無關通路；根據靶點在通路的富集定位，整合所有通路，構建丹參治療糖尿病神經病變靶點通路圖。

2 結果

2.1 丹參成分及其對應靶蛋白的收集與篩選以OB>30，DL>0.2作為篩選條件檢索 TCMSP 數據庫，得到丹參有效成分36個，見表1。

表1 丹參活性化合物基本信息

2.2 基因表達定位分析通過PharmMapper數據庫對36個化合物成分進行靶點預測；以Norm Fit>0.7作為篩選條件，最后成功注釋得到147個靶點，通過string構建靶點PPI，以結合系數>0.4作為條件篩選得到靶點133個，通過BioGPS數據庫查找133個基因靶點在心肝胰肺腎等器官的蛋白表達情況，結果發現54個基因在心臟表達最高，35個基因在肝臟表達最高，這與丹參的歸經“心肝”基本相符。129個基因與糖尿病神經病變相關，在心肝胰肺腎等器官均有表達，這也表明糖尿病神經病變是一個系統性疾病，病變涉及多個臟腑。見圖1。

圖1 “丹參-活性成分-預測靶點-器官”網絡圖

2.3 “丹參-活性成分-預測靶點-疾病”網絡構建與分析通過CTD數據庫檢索糖尿病神經病變疾病靶點，發現丹參治療糖尿病神經病變靶點129個；以丹參活性成分及預測靶點為基礎，構建“丹參活性成分-靶點”預測網絡；該網絡包含171個節點及2 664條邊，平均度數15.58，以degree>30作為篩選條件得到丹參治療糖尿病神經病變關鍵靶點32個。見圖2。

圖2 丹參“活性成分-預測靶點”的相互作用網絡

2.4 GO富集分析將32個丹參治療糖尿病神經病變關鍵靶點進行GO富集分析，以P<0.05進行篩選，得到與丹參治療糖尿病神經病變相關的生物功能條目33條，主要涉及蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、磷酸酶結合、泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、酶激活劑活性、MAP激酶活性、MAP激酶活性、氧化還原酶活性、核受體活性等相關生物功能。見表2。

表2 丹參治療糖尿病神經病變GO富集分析數據表

2.5 KEGG富集分析將32個丹參治療糖尿病神經病變關鍵靶點進行KEGG富集分析，以P<0.05進行篩選，剔除無關通路后得到與丹參治療糖尿病神經病變相關的信號通路23條，主要包括VEGF信號通路、Sphingolipid信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路、ErbB信號通路、AMPK信號通路。靶點在通路上的富集結果顯示，FoxO 信號通路、PI3K-Akt信號通路及MAPK信號通路富集的靶點最多，以這3條通路進行實驗驗證的可行性高，見表3。

表3 丹參治療糖尿病神經病變KEGG富集分析數據表

3 討論

隨著社會生活習慣、作息飲食習慣的改變，糖尿病發病率逐年上升。有數據表明，2016年全球糖尿病患者總數約3.82 億[15]，2013 年我國糖尿病發病率已達到 10.4%[16]。糖尿病神經病變為糖尿病常見并發癥，其中糖尿病周圍神經病變最為常見。糖尿病周圍神經病變患者常出現肢體麻木、疼痛，并伴有感覺和運動障礙，這不僅嚴重影響患者生活質量，而且對社會和家庭造成沉重的負擔。因此，早期積極防治糖尿病神經病變具有重要的意義。現代醫學治療糖尿病神經病變主要以控制血糖、改善循環和營養神經為主，雖然可以改善癥狀，緩解疼痛，但是未能根治糖尿病神經病變[17]。

黃東輝等[18]發現丹參水提物可顯著提高糖尿病大鼠的神經傳導速度、恢復神經功能，且丹參注射液對糖尿病神經病變的治療效果也已經得到循證醫學的證明[19]。有研究發現，丹參多酚酸鹽可提高糖尿病周圍神經病變療效，降低糖尿病周圍神經病變患者的炎性因子水平，提高周圍神經傳導速度，且無明顯不良反應[20-21]。韋凌云等[22]還發現丹參多酚酸鹽能改善血管內皮功能。陳月嬋[23]研究發現丹參酮-ⅡA與甲鈷胺聯合有效降低血液黏稠度，改善微循環，而這可能與背根神經節過度興奮及鈉通道蛋白表達的干預有關[24]。這些研究結果均顯示丹參對于糖尿病神經病變具有確切療效。

糖尿病神經病變病機復雜，其病變涉及多個臟腑、多種病機途徑及多條信號通路。目前雖然已經有大量研究肯定了丹參對糖尿病神經病變的治療作用，但丹參中包含化合物眾多，涉及多個靶點，要想明確丹參治療糖尿病神經病變的機制就顯得困難重重。網絡藥理學是通過分析大數據來進行藥物研究的新模式[25-26]，通過網絡藥理學方法，可以預測丹參治療糖尿病神經病變的靶點以及機制，從而指導丹參治療糖尿病神經病變的研究方向。本研究通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)、PubChem數據庫、PharmMapper數據庫、CTD數據庫、STRING數據庫、DAVID數據庫，收集丹參藥物成分及靶點相關信息，最后通過Cytoscape 3.6.1 軟件進行可視化處理。結果發現，丹參具有多成分多靶點特性，丹參133個基因靶點在心肝胰肺腎等器官的蛋白表達情況，結果發現54個基因在心臟表達最高，35個基因在肝臟表達最高，這與丹參的歸經心肝基本相符。129個基因與糖尿病神經病變相關，在心肝胰肺腎等器官均有表達，這也表明糖尿病神經病變是系統性疾病，病變涉及多個臟腑。富集分析結果顯示，丹參治療糖尿病神經病變涉及的信號通路23條，其中 FoxO 信號通路、PI3K-Akt信號通路及MAPK信號通路富集的靶點最多，提示丹參發揮作用主要與這3條通路有關，GO富集分析的結果也進一步支撐了這個結論。目前最新研究也表明，MAPK信號通路[27-29]、PI3K-Akt信號通路及FoxO 信號通路[30]與糖尿病神經病變的發病密切相關，這也從反面驗證了本研究結果的準確性。表明本研究結果可以為后續從丹參中提取有效藥物成分治療糖尿病神經病變提供重要依據，而這也將對未來論證中醫藥基礎理論的科學性提供有價值的參考。