疏肝溫膽湯對胰島素抵抗肥胖大鼠糖脂代謝和炎癥因子的影響

羅思聰，郭永寧，蔡海榮，蔡鑫桂，張為章，張烈元，陳伯鈞

（1.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405）

肥胖是高血壓、糖尿病、代謝綜合征、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的重要危險因素，已成為影響我國居民健康的十大危險因素之一和全球最主要的公共衛(wèi)生問題[1]。隨著生活飲食習慣的改變和運動的減少，肥胖發(fā)病率日益升高。流行病學調(diào)查顯示，全球超體質(zhì)量的成年人數(shù)超過18億，其中，肥胖超過6億，預計到2025年肥胖人數(shù)超過全球總?cè)藬?shù)的1/5[2]。我國目前成年居民超體質(zhì)量率和肥胖率分別為30.1%和11.9%，并且發(fā)病率逐年升高[3]。胰島素抵抗是導致肥胖的主要機制，二者相輔相成，相繼發(fā)生，胰島素抵抗患者多伴有肥胖，所有肥胖者幾乎均伴有胰島素抵抗、高血糖、高血脂、代謝綜合征等代謝相關性疾病，其中，胰島素抵抗是共同的病理基礎[4]。有學者指出，肥胖是一種慢性低度炎癥反應狀態(tài)[5]，肥胖患者中的脂肪組織可以分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-17、IL-1β等多種炎性細胞因子，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應，抑制細胞內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導，加重胰島素抵抗。因此，肥胖狀態(tài)下的胰島素抵抗與炎性反應密切相關。中醫(yī)學認為肥胖與痰濕密切相關，疏肝溫膽湯是陳伯鈞教授治療代謝綜合征的經(jīng)驗方，前期臨床研究[6]發(fā)現(xiàn)，其可以改善肥胖型代謝綜合征患者的血脂、血糖。在此基礎上，本研究擬通過建立胰島素抵抗肥胖大鼠模型，從糖脂代謝和炎癥反應角度探討疏肝利膽湯的作用機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料SPF級4月齡健康SD大鼠40只，體質(zhì)量（180±20）g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2018-0002。分籠飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%。高脂飼料按質(zhì)量分數(shù)配方：普通基礎飼料53.2%、豬油15%、蛋黃粉10%、蔗糖20%、膽酸鈉0.2%、預混料0.4%、膽固醇1.2%。普通基礎飼料和高脂飼料購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 藥物及制備疏肝溫膽湯（柴胡12 g，白芍20 g，陳皮12 g，法半夏9 g，枳實12 g，竹茹20 g，茯苓20 g，丹參20 g，甘草6 g）的中藥飲片由廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院提供，均購自康美藥業(yè)股份有限公司。以一付藥劑量分別加4倍量的水煎煮2次，每次煎煮1 h，濾渣取液，藥液混合后濃縮至1 g/mL，4℃保存。阿托伐他汀鈣片，由輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號為20180543，加生理鹽水配制成0.10 mg/mL濃度的混懸液。

1.3 試劑與儀器總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒（南京卡米洛生物工程有限公司）；TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；胰島素檢測試劑盒（德國DRG公司）。Multiskan Sky 450 nm酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；高精度加樣器（瑞士Mettler Toledo公司）；37℃恒溫箱（韓國Daihan Scientific公司）；日立7180型自動生化分析儀（日本Hitachi公司）；CT14RD型低溫冷凍離心機（北京天美科技有限公司）；血糖儀（長沙三諾生物傳感股份有限公司）。

1.4 動物分組與模型構建參照文獻[7]方法采用高脂膳食誘導胰島素抵抗肥胖大鼠模型。方法：將40只大鼠分籠（4只/籠）適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組（10只）和造模組（30只）。正常組大鼠予以普通基礎飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)，造模時間為8周。肥胖模型建立標準：體質(zhì)量增長率=[（造模后體質(zhì)量-造模前體質(zhì)量）/造模前體質(zhì)量]×100%≥20%。胰島素抵抗模型建立標準：胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=空腹血糖（FBG）×空腹胰島素（Fins）/22.5，造模組穩(wěn)態(tài)模型HOMA-IR較正常組顯著升高（P＜0.05）。最終造模組中有24只大鼠符合胰島素抵抗肥胖大鼠模型標準，然后將其隨機分為模型組、中藥組、他汀組，每組8只。

1.5 給藥方法從第9周開始給藥，按照徐叔云主編的《藥理實驗方法學》[8]中人鼠藥物劑量換算方法，中藥組大鼠給予疏肝溫膽湯11.66 g·kg-1·d-1灌胃，他汀組大鼠給予阿托伐他汀鈣片混懸液1.05 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組大鼠給予等體積的生理鹽水（2 mL/d）灌胃，每日分2次進行，共4周。

1.6 觀察指標與方法于完成造模、給藥結(jié)束后，末次給藥后禁食不禁飲12 h腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，逐層打開腹腔，腹主動脈取血10 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，-80℃保存，待測。摘取附睪和腎周脂肪等脂肪組織，電子天平稱質(zhì)量。

1.6.1 大鼠一般情況觀察 記錄大鼠死亡情況。每周末檢測大鼠的體質(zhì)量和體長（鼻子至肛門的距離）。計算Lee’s指數(shù)，Lee’s指數(shù)=

1.6.2 糖脂代謝相關指標測定 末次給藥后禁食不禁飲12 h，應用血糖儀檢測FBG水平，放射免疫分析法檢測Fins水平，計算胰島素敏感性指數(shù)（QUICKI）和HOMA-IR，全自動生化分析儀檢測血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。計算QUICKI=1/（lgFBG+lgFins）。計算脂肪指數(shù)，脂肪指數(shù)=脂肪質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.6.3 ELISA法檢測脂肪組織中TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β含量 摘取大鼠附睪脂肪組織，剪碎，勻漿。以5 000×g離心15 min，取上清液，于-80℃保存。采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β含量，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計方法應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 造模8周后大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、FBG、Fins、HOMA-IR水平造模8周后，造模組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、FBG、Fins、HOMA-IR均顯著高于正常組（P＜0.05），且大鼠體質(zhì)量增長率為24.67%，大于20%，HOMA-IR升高，提示成功建立胰島素抵抗肥胖大鼠模型。結(jié)果見表1。

表1 造模8周后大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、FBG、Fins、HOMA-IR水平Table 1 The body mass，Lee’s index，F(xiàn)BG，F(xiàn)ins，HOMA-IR in rats after 8 weeks of modeling （±s）

表1 造模8周后大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、FBG、Fins、HOMA-IR水平Table 1 The body mass，Lee’s index，F(xiàn)BG，F(xiàn)ins，HOMA-IR in rats after 8 weeks of modeling （±s）

①P＜0.05，與正常組比較

組別正常組造模組鼠數(shù)（只）10 30體質(zhì)量（g）402.34±38.41 496.37±43.62①Lee’s指數(shù)301.24±26.71 351.36±34.16①FBG（mmol·L-1）5.27±0.63 7.12±1.02①Fins（mIU·L-1）3.42±0.27 5.63±0.41①HOMA-IR 0.80±0.05 1.78±0.16①

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)的比較與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；與他汀組比較，中藥組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)的比較Table 2 Comparison of the body mass，Lee’s index，fat index in various groups （±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)的比較Table 2 Comparison of the body mass，Lee’s index，fat index in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組他汀組鼠數(shù)（只）10 8 8 8體質(zhì)量（g）489.72±34.76 591.24±51.37①514.75±42.53②506.62±51.38②Lee’s指數(shù)312.44±37.12 381.39±28.46①324.56±38.52②319.43±45.18②脂肪指數(shù)（%）9.12±0.09 16.75±1.05①9.68±0.14②10.02±0.17②

2.3 各組大鼠糖代謝指標的比較與正常組比較，模型組大鼠FBG、Fins、HOMA-IR顯著升高（P＜0.05），QUICKI顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠FBG、Fins、HOMA-IR顯著降低（P＜0.05），QUICKI顯著升高（P＜0.05）；與他汀組比較，中藥組大鼠FBG、Fins、HOMA-IR差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠糖代謝指標的比較Table 3 Comparison of the glucose metabolism indexes in various groups （±s）

表3 各組大鼠糖代謝指標的比較Table 3 Comparison of the glucose metabolism indexes in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組他汀組鼠數(shù)（只）10 888 FBG（mmol·L-1）5.29±0.73 9.86±1.13①5.63±1.23②5.49±0.67②Fins（mIU·L-1）3.79±0.42 9.43±1.38①4.13±0.87②4.05±1.02②HOMA-IR 0.91±0.07 4.13±0.94①1.06±0.12②1.02±0.21②QUICKI 0.77±0.05 0.51±0.06①0.73±0.11②0.74±0.08②

2.4 各組大鼠血脂水平的比較與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C顯著升高（P＜0.05），HDL-C顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠血清TC、TG、LDL-C顯著降低（P＜0.05），HDL-C顯著升高（P＜0.05）；但中藥組大鼠血清TC、LDL-C高于他汀組（P＜0.05），HDL-C低于他汀組（P＜0.05）。表明疏肝溫膽湯雖然有降低TC、LDL-C、升高HDL-C含量的作用，但未達到阿托伐他汀的降脂效果。具體結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血脂水平的比較Table 4 Comparison of the blood lipids levels in various groups （±s，mmol·L-1）

表4 各組大鼠血脂水平的比較Table 4 Comparison of the blood lipids levels in various groups （±s，mmol·L-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與他汀組比較

組別正常組模型組中藥組他汀組鼠數(shù)（只）10 888 TC 2.03±0.26 3.12±0.64①2.12±0.31②③1.85±0.27②TG 0.86±0.09 1.67±0.13①0.91±0.12②0.73±0.08②LDL-C 1.41±0.07 2.13±0.21①1.56±0.18②③1.32±0.15②HDL-C 0.61±0.04 0.42±0.03①0.52±0.06②③0.60±0.04②

2.5 各組大鼠脂肪組織炎性細胞因子水平的比較與正常組比較，模型組大鼠脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平顯著降低（P＜0.05）；與他汀組比較，中藥組大鼠脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠脂肪組織炎性細胞因子水平的比較Table 5 Comparison of the inflammatory cytokines in adipose tissue in various groups （±s，pg·mg-1）

表5 各組大鼠脂肪組織炎性細胞因子水平的比較Table 5 Comparison of the inflammatory cytokines in adipose tissue in various groups （±s，pg·mg-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組他汀組鼠數(shù)（只）10 888 TNF-α 86.24±13.24 194.25±36.24①92.37±12.74②94.38±18.42②IL-6 48.72±6.49 72.43±8.12①51.36±5.28②53.16±7.28②IL-17 56.97±8.23 86.72±9.12①60.34±6.54②62.39±7.15②IL-1β 98.36±10.24 184.36±18.43①103.68±12.73②105.43±18.35②

3 討論

肥胖和胰島素抵抗是糖尿病、高血壓、代謝綜合征、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病等多種疾病的重要危險因素，因此，早期干預肥胖和胰島素抵抗對預防其進展為各種心腦血管疾病具有重要的意義。胰島素抵抗肥胖大鼠主要表現(xiàn)為體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)增加，糖脂紊亂，空腹血糖、胰島素和血脂水平升高。肥胖狀態(tài)系由于胰島素受體減少或敏感性降低，引起血清中胰島素分泌水平升高，導致胰島素抵抗，表現(xiàn)為QUICKI降低和HOMA-IR升高[9]。

胰島素抵抗與肥胖相輔相成，兩者共同影響并共同引起代謝綜合征、高血糖、高血壓等代謝性疾病，均表現(xiàn)為糖脂代謝紊亂。高脂膳食誘導狀態(tài)下，大鼠的脂肪組織進行快速脂代謝，引起血液中的游離脂肪酸流入肝臟，刺激糖異生，使甘油三酯合成增加，抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導，最終導致糖脂代謝紊亂，發(fā)生高血糖、高胰島素血癥、代謝綜合征等[10]。越來越多的證據(jù)表明，慢性低度炎癥反應與肥胖、胰島素抵抗密切相關，主要表現(xiàn)為各種炎性細胞因子長期處于低水平升高狀態(tài)[11-12]。肥胖機體的炎性細胞因子主要由脂肪組織中的巨噬細胞合成分泌。其中，TNF-α可以通過促進胰島素受體絲氨酸磷酸化，抑制酪氨酸磷酸化，從而抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導，引起胰島素抵抗[13]；TNF-α還可以刺激IL-6、IL-17、IL-1β等其他炎性細胞因子的分泌，進一步加重炎癥級聯(lián)反應。有研究表明，敲除高脂飲食誘導的肥胖大鼠TNF-α基因可以降低體質(zhì)量和胰島素水平，提高胰島素敏感性[14]。IL-6也是與肥胖、胰島素抵抗密切相關的炎癥介質(zhì)，IL-6抗體處理可使肥胖大鼠體質(zhì)量降低，胰島素敏感性顯著升高[15]。

現(xiàn)代中醫(yī)學認為，痰濕是肥胖的核心病機，其既是重要的病理產(chǎn)物，也是最主要的致病因素。肥胖歸屬于中醫(yī)學“肥人”“肥滿”范疇，病位在脾、腎、胃三臟，多由于暴飲暴食、嗜食肥甘厚膩，不能運化水濕，痰濕內(nèi)聚，發(fā)為肥胖。清·陳修園認為：“大抵稟素之盛……惟是濕痰頗多。”陳伯鈞教授認為現(xiàn)代人生活壓力大，肝氣郁滯，氣機郁滯，不能運化水濕，痰濕內(nèi)聚，導致瘀血內(nèi)阻，發(fā)為肥胖。因此，陳伯鈞教授認為肝氣郁滯，痰瘀內(nèi)阻是肥胖、胰島素抵抗的重要病機，故運用疏肝溫膽湯這一經(jīng)驗方進行治療。方中柴胡為君，疏肝解郁；陳皮、法半夏為臣，化痰理氣；佐以白芍柔肝斂肝，以防疏導太過，枳實調(diào)理氣機，丹參活血化瘀；甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏疏肝理氣、化痰祛瘀之功。本課題組在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，疏肝溫膽湯可以控制代謝綜合征患者的血脂與血糖，而且初步發(fā)現(xiàn)其可以降低代謝綜合征患者的血清hs-CRP含量[6]。因此，疏肝溫膽湯治療代謝綜合征是有效的，但是其治療作用是否與調(diào)控炎癥介質(zhì)相關尚未明確。基于此，本研究將SD大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥組和他汀組，采用高脂膳食喂養(yǎng)建立胰島素抵抗肥胖大鼠模型，并分別給予相應的藥物干預。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)、HOMAIR升高（P＜0.05），QUICKI顯著降低（P＜0.05），血清FBG、Fins、TC、TG、LDL-C水平升高（P＜0.05），HDL-C水平降低（P＜0.05），脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β含量升高（P＜0.05）。表明高脂膳食可成功誘導大鼠體質(zhì)量升高、糖脂代謝紊亂，出現(xiàn)胰島素抵抗，成功構建了胰島素抵抗肥胖大鼠模型，并且表現(xiàn)出炎性反應狀態(tài)。與模型組比較，中藥組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、脂肪指數(shù)、HOMA-IR降低（P＜0.05），QUICKI顯著升高（P＜0.05），血清FBG、Fins、TC、TG、LDL-C水平降低（P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05），脂肪組織TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β含量降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，疏肝溫膽湯可以降低胰島素抵抗肥胖大鼠的體質(zhì)量，改善其糖脂代謝和胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，這與本課題組前期臨床研究結(jié)果一致，而且本研究結(jié)果還表明疏肝溫膽湯可以抑制其炎癥反應狀態(tài)。

綜上所述，疏肝溫膽湯可以改善胰島素抵抗肥胖大鼠的糖脂代謝，并抑制其炎癥反應狀態(tài)。