七葉皂苷鈉通過調節Keap1/Nrf2/HO-1信號通路抑制神經元細胞凋亡改善蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷

李侑埕，陳立剛，孔睿，梁國標

（1.錦州醫科大學北部戰區總醫院研究生培養基地神經外科，遼寧沈陽 121001；2.北部戰區總醫院神經外科，遼寧沈陽 110016）

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）具有相當高的死亡率和發病率[1-2]。因此，預防和減輕蛛網膜下腔出血后的腦損傷具有重要的意義。目前，早期腦損傷（early brain injury，EBI）被指出可能是蛛網膜下腔出血患者的主要死亡原因[3]，成為新的研究熱點。天師栗，是七葉樹科植物天師栗Aesculus wilsoniiRehd.及七葉樹A.chinensisBge.的果實或種子，通稱娑羅子，具有寬中、下氣、殺蟲的功效，用于治療胃寒疼痛，脘腹脹滿，疳積蟲痛，痢疾，瘧疾。七葉皂苷鈉是天師栗成熟種子的三萜皂苷的鈉鹽提取物。研究表明，七葉皂苷鈉具有抗炎、消腫、抗滲出，改善微循環、增強血管張力收縮性，抗氧化、清除自由基，抗腫瘤，神經保護等作用，對軟組織損傷、心腦血管疾病和滲出性疾病具有治療價值[4]。已有大量臨床和實驗研究表明，七葉皂苷鈉對腦損傷有修復作用[5]。基于此，本研究探討七葉皂苷鈉是否對蛛網膜下腔出血后的早期神經損傷發揮保護作用，以期為七葉皂苷鈉臨床治療蛛網膜下腔出血提供依據。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性C57BL/6J小鼠，體質量18～22 g，清潔級，購自北部戰區總醫院實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（遼）2014-0002。小鼠分籠飼養，每籠5～8只，飼養室溫為23～25℃，相對濕度40%～80%，自由飲水進食。本研究獲北部戰區總醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物、試劑與儀器七葉皂苷鈉購自山東綠葉制藥有限公司（批號：H20003239），分子量1 124.2。七葉皂苷鈉用生理鹽水使之充分溶解，工作液濃度為2.8 mg/kg，現用現配[6]。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）、血紅素氧合酶1（HO-1）等抗體（美國Abcam公司）；核因子E2相關因子2（Nrf2）、β-actin（美國Santa Cruz公司）；伊文思藍（美國Sigma-Aldrich公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、原位末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）標記（TUNEL）染色試劑盒、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、電化學發光（ECL）試劑盒（碧云天公司）；神經元核抗原（NeuN）抗體（美國Abcam公司）；Alexa Fluor 594熒光抗體（美國Sigma公司）。ar-2130型分析天平（美國安泰克公司）；dhg-9240a型鼓風干燥箱（上海精密科學儀器公司）；rad3cell型微量蛋白電泳儀（美國北京伯樂分析生化儀器公司）。

1.3 分組、造模與給藥將小鼠隨機分為3組，包括假手術組（32只）、模型組（48只）、七葉皂苷鈉組（38只）。參考文獻[3，7]采用頸內動脈穿刺法建立小鼠蛛網膜下腔出血模型。方法：將小鼠用10 g/L戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，顯露頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈；經頸外動脈向頸內動脈插入4-0尼龍線，進一步插入顱內頸內動脈，直到感覺到阻力，然后再推入5 mm，以穿透頸內動脈壁。假手術組接受除不刺穿頸內動脈外相同的手術。造模結束1 h后，七葉皂苷鈉組小鼠給予一次性腹腔注射七葉皂苷鈉2.8 mg/kg，假手術組和模型組小鼠給予一次性腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 神經功能評分 于蛛網膜下腔出血后24 h行盲法評定神經學評分，包括改良的Garcia評分和平衡木測試[8]。改良的Garcia評分細則見表1。平衡木測試：將90 cm長、1 cm寬的圓柱形橫木放在2個平板中間，實驗前將大鼠在兩側平板上分別放置10 s，然后把大鼠放在橫木中間，觀察其移動。根據步行距離進行評分：40 s內沒有移動，且直接從橫木上跌落，計0分；40 s內沒有跌落，也沒有移動，計1分；40 s內移動了22 cm（放置位置到平板的一半）并且停留在該位置至少25 s，計2分；40 s內移動了超過22 cm（放置位置到平板的一半）并且停留在該位置至少25 s，計3分；40 s內到達平板或者25 s內走完一半的距離沒爬上平板，計4分；25 s內到達平板，計5分。計算連續次試驗的平均得分。分數越高，表示神經功能越好。

1.4.2 蛛網膜下腔出血分級 深度麻醉小鼠后取腦組織，進行蛛網膜下腔出血評分[9]。將Willis動脈環和基底動脈環分為6段，根據蛛網膜下腔血凝塊的多少，各節段評分0～3分。蛛網膜下腔出血分級分為3組：輕度，0～7分；中度，8～12分；重度：13～18分。

1.4.3 腦含水量 于蛛網膜下腔出血后24 h深麻醉小鼠取腦。取出后立即稱濕質量，在10℃烘箱中烘干72 h后稱干質量，計算腦含水量。公式[10]：腦含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.4.4 伊文思藍滲出法檢測血腦屏障完整性 于蛛網膜下腔出血后24 h，經尾靜脈注射伊文思藍染料（20 g/L；5 mL/kg）。60 min后深度麻醉小鼠，經心內灌注磷酸鹽緩沖液（PBS）去除血管內伊文思藍。取出大腦，稱量腦組織加入PBS勻漿，以5 000×g離心40 min。將上清液與等體積的含有三氯乙酸和乙醇（1∶3）的溶液混合，4℃孵育過夜，以15 000×g離心30 min，取上清液。用熒光分光光度計測定上清液中伊文思藍的濃度。

1.4.5 TUNEL/NeuN/DAPI三色免疫熒光染色法觀察神經元細胞凋亡 將腦組織切片用蛋白酶37℃消化15 min，PBS水洗，滴加TDT+DIGUTP混合液，37℃孵育2 h，PBS水洗；滴加封閉液置室溫孵育30 min，滴加抗地高辛抗體+NeuN抗體混合液4℃孵育過夜。PBS洗后滴加熒光二抗37℃孵育30 min。最后以DAPI復染細胞核，顯微鏡下觀察。計數TUNEL和NeuN陽性細胞數。

1.4.6 蛋白免疫印跡法檢測腦組織Keap1、Nrf2、HO-1表達 于蛛網膜下腔出血后24 h取小鼠左側大腦半球，加入RIPA裂解液提取蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并轉移到硝酸纖維素膜上，分別與Keap1、Nrf2、HO-1、β-actin等一抗共同置于4℃孵育過夜，再以二抗室溫處理1 h。用ECL試劑盒將電泳條帶可視化，用ImageJ軟件分析電泳條帶的灰度值。以β-actin為內參，以目的蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.5 統計方法采用Graph Pad Prism 5軟件和SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。數據以均數±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，然后進行Tukey事后檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 七葉皂苷鈉對蛛網膜下腔出血小鼠死亡率、出血量及神經功能的影響圖1-A結果顯示，假手術組小鼠死亡率為0%（0/32），模型組小鼠死亡率為33.33%（16/48），七葉皂苷鈉組為15.79%（6/38），表明七葉皂苷鈉干預后明顯降低了蛛網膜下腔出血小鼠的死亡率。圖1-B結果顯示，模型組小鼠蛛網膜下腔出血評分較假手術組顯著增加（P＜0.05），七葉皂苷鈉組小鼠蛛網膜下腔出血評分較模型組顯著降低（P＜0.05），表明七葉皂苷鈉可減少蛛網膜下腔出血小鼠的出血量。對蛛網膜下腔出血后24 h小鼠神經功能進行評估，結果如圖1-C、D所示，模型組Garcia評分和平衡木測試評分較假手術組顯著降低，而七葉皂苷鈉組Garcia評分和平衡木測試評分較模型組升高（P＜0.05），提示七葉皂苷鈉能夠促進蛛網膜下腔出血小鼠神經功能的恢復。

圖1 七葉皂苷鈉對蛛網膜下腔出血小鼠死亡率、出血量及神經功能的影響Figure 1 Effects of sodium aescinate on mortality，subarachnoid hemorrhage and nerve function in mice with subarachnoid hemorrhage

2.2 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網膜下腔出血后血腦屏障的影響圖2-A結果顯示，模型組小鼠蛛網膜下腔出血后24 h腦含水量較假手術組顯著增加，七葉皂苷鈉組腦含水量較模型組顯著減少。表明七葉皂苷鈉給藥后可顯著減少小鼠蛛網膜下腔出血引起的腦水腫。圖2-B結果顯示：與假手術組比較，模型組小鼠腦組織伊文思藍滲出量增加（P＜0.05）；與模型組比較，七葉皂苷鈉組腦組織伊文思藍滲出量減少（P＜0.05）。表明小鼠蛛網膜下腔出血后24 h全腦血腦屏障完整性被破壞，七葉皂苷鈉可減輕腦水腫，對全腦血腦屏障有保護作用。

圖2 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網膜下腔出血后血腦屏障的影響Figure 2 Effects of sodium aescinate on blood-brain barrier in mice with subarachnoid hemorrhage

2.3 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網膜下腔出血后神經元凋亡的影響采用TUNEL/NeuN/DAPI三色免疫熒光染色法觀察七葉皂苷鈉對小鼠蛛網膜下腔出血后神經元凋亡的影響，“NeuN”標志神經元細胞，“TUNEL”染色顯示凋亡細胞，“Merge”表示神經元細胞凋亡，如圖3所示。圖4結果表明，模型組蛛網膜下腔出血小鼠神經元凋亡陽性細胞數目增加，而七葉皂苷鈉干預后神經元凋亡陽性細胞數目減少，表明七葉皂苷鈉能夠抑制小鼠蛛網膜下腔出血后神經元細胞的凋亡，具有保護神經的作用。

圖3 各組小鼠腦組織TUNEL/NeuN/DAPI三色熒光染色圖像比較Figure 3 Comparison of TUNEL/NeuN/DAPI immunofluorescence staining images in various groups of mice

圖4 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網膜下腔出血后神經元凋亡的影響Figure 4 Effects of sodium aescinate on the apoptosis of nerve cells in mice of subarachnoid hemorrhage

2.4 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網膜下腔出血后腦組織Keap1/Nrf2/HO-1信號通路的影響圖5結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠腦組織Keap1蛋白表達水平降低，而Nrf2、HO-1蛋白表達水平升高（均P＜0.05）。與模型組比較，七葉皂苷鈉小鼠腦組織Keap1蛋白表達水平升高，而Nrf2、HO-1表達水平降低（均P＜0.05）。表明七葉皂苷鈉可能通過調節小鼠腦組織Keap1/Nrf2/HO-1信號通路蛋白減輕蛛網膜下腔出血。

圖5 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網膜下腔出血后腦組織Keap1/Nrf2/HO-1信號通路的影響Figure 5 Effects of sodium aescinate on Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway in mice with subarachnoid hemorrhage

3 討論

早期腦損傷通常發生在蛛網膜下腔出血后72 h內，在決定蛛網膜下腔出血患者預后中發揮關鍵作用[11-12]。與血管痙攣損傷機制不同，早期腦損傷可在蛛網膜下腔出血后立即對腦組織造成損傷[13]。早期腦損傷的可能機制包括顱內壓（intracranial pressure，ICP）升高，腦血流量（cerebral blood flow，CBF）降低，腦灌注壓（cerebral perfusion pressure，CPP）降低，腦氧合下降，血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞，腦水腫和神經細胞死亡等[14]。本研究結果表明，七葉皂苷鈉給藥能夠顯著改善蛛網膜下腔出血小鼠血腦屏障損傷及神經功能缺損，減輕蛛網膜下腔出血后早期腦損傷。

NeuN蛋白能夠特異性結合神經核[15]，且廣泛存在于脊椎動物神經系統各個部位的成熟神經細胞核內，更重要的是它在這些物種體內高度保守且在神經細胞生長的特殊階段穩定表達[16]，故常直接被用作神經細胞的特異性標記物，同時也是直接評價神經細胞丟失、死亡以及量化治療效應的可信標記物[17]。NeuN蛋白表達的高低可明確反映神經細胞數量的變化。本研究結果表明七葉皂苷鈉能夠減輕小鼠蛛網膜下腔出血早期腦損傷神經元細胞的凋亡，提示七葉皂苷鈉對小鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷可能具有修復作用。

Keap1-Nrf2/ARE通路是近年新發現的機體抵抗外界氧化和化學等刺激的防御性轉導通路[18]。越來越多的證據表明，Nrf2調控的基因產物在中樞神經系統疾病中具有保護作用。在非應激條件下，Nrf2失活，并被Keap1（Nrf2的抑制蛋白）隔離在細胞質中[19]；然而，當暴露于各種刺激時，復合物被分離，游離的Nrf2隨后移位到細胞核并與抗氧化相關元件（ARE）結合，導致各種抗氧化和解毒基因的表達，如HO-1[17-18]。HO-1被認為是細胞氧化應激過程中一個非常敏感的指標[20]。HO-1與其催化血紅素降解生成的產物膽紅素和CO一道，組成了機體重要的內源性保護系統，廣泛參與抗炎與多種急慢性氧化應激損傷。多種生長因子、氧化刺激因素、抗氧化藥物等能上調HO-1的表達[21]。而HO-1催化血紅素的降解產物CO、膽紅素和鐵蛋白可發揮細胞保護作用[22]。本研究結果表明，七葉皂苷鈉可明顯上調蛛網膜下腔出血小鼠腦組織Keap1蛋白表達，下調Nrf2、HO-1的表達，提示七葉皂苷鈉可能通過調節小鼠腦組織Keap1/Nrf2/HO-1信號通路減輕蛛網膜下腔出血。

綜上所述，七葉皂苷鈉可以有效改善蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷，其機制可能與調節Keap1/Nrf2/HO-1信號通路從而抑制神經元細胞凋亡有關。提示七葉皂苷鈉可能是一種治療蛛網膜下腔出血早期腦損傷的潛在藥物。