附子理中湯治療2型糖尿病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制

林志勤，施嵐?fàn)枺嵜浪迹煺轮?/p>

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一組由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用，以慢性血糖升高為特征，伴有脂代謝、蛋白代謝紊亂的臨床代謝癥候群。隨著人們生活水平的提高，2型糖尿病的發(fā)病率迅速提高，且年齡日趨年輕化[1]。目前，尚無徹底治愈2型糖尿病的方法，但基于安全性、經(jīng)濟(jì)性和有效性，中藥被認(rèn)為是一種潛在的治療糖尿病的方法。

2型糖尿病屬于祖國醫(yī)學(xué)中“消渴病”的范疇。《素問·氣厥論》記載：“心移寒于肺，肺消。肺消者，飲一溲二，死不治。”提出了因寒致消渴之說。《普濟(jì)本事方》記載：“肺為五臟華蓋，若下有冷極，則陽氣不能升，故肺干消渴。”提出了由腎陽虛衰而致消渴之說。朱章志教授從六經(jīng)辨證出發(fā)，認(rèn)為消渴病早期病在陽明，遷延日久，虛化寒化而轉(zhuǎn)屬太陰，在治療上多選用附子理中湯[2]，具有良好療效。附子理中湯是宋代醫(yī)家閻孝忠在張仲景理中丸的基礎(chǔ)上，加用大辛大熱的附子而成。附子理中湯治療糖尿病及其并發(fā)癥已有很多報(bào)道，如張智勇使用附子理中湯治療2型糖尿病23例，療效顯著[3]；王振剛等[4]使用附子理中湯治療糖尿病，發(fā)現(xiàn)其能夠下調(diào)胃動(dòng)素、胃泌素水平，改善糖尿病胃輕癱。但是，附子理中湯中含有多種藥物成分，其治療2型糖尿病的作用機(jī)制尚不明確，目前，發(fā)掘中藥復(fù)方發(fā)揮作用的潛在機(jī)制仍然十分困難，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展則為其提供了可能。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，通過系統(tǒng)綜合地觀察藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，揭示多分子藥物的協(xié)同作用[5]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討附子理中湯治療2型糖尿病的作用靶點(diǎn)及其相關(guān)通路，以期為今后的實(shí)驗(yàn)研究提供研究方向及理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 附子理中湯的活性成分與靶點(diǎn)挖掘在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中獲取附子理中湯中各味中藥（附子、干姜、白術(shù)、人參、甘草）的化學(xué)成分，設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，篩選出符合條件的候選化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，然后借助Uniprot數(shù)據(jù)庫，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因，得到附子理中湯的基因靶點(diǎn)。

1.2 2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)獲取與藥物作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)以“type 2 diabetes mellitus”為檢索詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中搜索2型糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)，然后把所得疾病靶點(diǎn)與附子理中湯的靶點(diǎn)使用R語言程序進(jìn)行交集，以此得到出共同的靶點(diǎn)，同時(shí)繪制韋恩圖，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)。

1.3“中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析利用Cytoscape 3.7.0軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。節(jié)點(diǎn)（node）代表附子理中湯中所含藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)；邊（edge）代表中藥成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況篩選出附子理中湯作用于2型糖尿病的關(guān)鍵化合物。

1.4 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）進(jìn)行PPI分析，限定研究物種為“人”（Homo Sapiens），最低相互作用評(píng)分設(shè)置為最高置信度[“Highest Confidence（0.900）”]，同時(shí)設(shè)置隱藏游離點(diǎn)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，下載附子理中湯作用于2型糖尿病的PPI網(wǎng)絡(luò)圖片和TSV格式文件。將STRING中下載的TSV文件用R語言進(jìn)行篩選，選出關(guān)聯(lián)度最大的前30個(gè)蛋白。

1.5 基因本體論（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析使用R語言將藥物-疾病交集基因修正成官方名稱（official gene symbol），再使用R語言中的“Clusterprofiler”“Bioconductor”等生物類程序包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最后使用R語言將數(shù)據(jù)處理結(jié)果繪制成GO功能分析和KEGG通路富集分析的條形圖和氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物-疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果在TCMSP中設(shè)定OB≥30%、BL≥0.18，得到有效化合物147個(gè)，其中，附子21個(gè)，干姜5個(gè)，白術(shù)7個(gè)，人參22個(gè)，甘草92個(gè)。逐一對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，去除無靶點(diǎn)化合物后得到有效化合物共125個(gè)，刪除重復(fù)后共106個(gè)；對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)201個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共計(jì)112個(gè)。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)基因共7 894個(gè)，最后使用R語言制作韋恩圖，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)103個(gè)，分別為NCOA2、CHRM1、PLAU、SELE、AKR1C3、GRIA2、CCND1、PTGS1、ADRA1A、CTRB1、VCAM1、RXRG、OLR1、EIF6、ACHE、CHRM2、HTR3A、CYP1B1、NFKBIA、FASN、RB1、PRSS1、GABRA1、PPARG、ALOX5、CASP1、LDLR、EGFR、PGR、BCL2、F7、GSTP1、PSMG1、MTTP、VEGFA、NCOA1、CASP9、RELA、AHR、NR3C1、APOB、FOS、ESR1、CASP3、IKBKB、SLC2A4、CHRM5、SREBF1、IL-6、CHEK1、CASP8、MAPK8、NR1I3、GSK3B、ABCC1、ELK1、NR3C2、PRKCA、CYP3A4、GSTM1、ESR2、ABAT、POR、AR、PON1、CYP1A1、GSTM2、MAPK10、RXRB、RAF1、CHRM3、AKR1B1、ICAM1、PARP1、CRP、IGF2、RASA1、HIF1A、MYC、HSPB1、COL3A1、RUNX2、IRF1、CAV1、RUNX1T1、PTGER3、MGAM、DCAF5、RASSF1、ERBB3、NOS3、ERBB2、BIRC5、CCNB1、CHEK2、CTSD、HK2、NQO1、ACACA、DUOX2、NFE2L2、HSF1、IGFBP3。

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析結(jié)果借助Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建中藥化合物-靶點(diǎn)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有218個(gè)節(jié)點(diǎn)（附子理中湯化合物節(jié)點(diǎn)125個(gè)，刪除重復(fù)化合物后共106個(gè)，靶基因節(jié)點(diǎn)112個(gè)）和1 706條邊，見圖1。經(jīng)Cytoscape 3.7.0軟件對(duì)圖1進(jìn)行分析后，圖中：潛在靶點(diǎn)最多的化合物為槲皮素（quercetin），共72個(gè)；其次為山柰酚（kaempferol），共62個(gè)；再者是β-谷甾醇（betasitosterol），共28個(gè)。推測(cè)這些化合物可能是附子理中湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵化合物。

圖1 附子理中湯的“活性成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Network for active ingredient-target interaction in FuziLizh ong Tang

2.3 附子理中湯與2型糖尿病的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其核心基因?qū)㈨f恩圖得到的103個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)錄入STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析得到PPI（見圖2），其包含103個(gè)節(jié)點(diǎn)，202條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為3.92，PPI富集P值少于1.0e-16。其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。將STRING中下載的TSV格式文件用R語言進(jìn)行處理，得到PPI中的核心蛋白，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），雌激素受體1（ESR1），F(xiàn)os蛋白，核受體輔激活蛋白1（NCOA1）等，見圖3。推測(cè)這些蛋白可能是附子理中湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵蛋白。

圖2 附子理中湯治療2型糖尿病靶蛋白網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Network of target proteins in Fuzi Lizhong Tang for T2DM

圖3 PPI中的核心基因Figure 3 Core genes in PPI

2.4 GO功能富集分析通過運(yùn)行R語言分析后得到103個(gè)附子理中湯-2型糖尿病交集基因共影響了121個(gè)生物學(xué)過程（P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.01）。P值代表富集的顯著性，選取P值最小的前20個(gè)功能信息，制作成GO功能富集的氣泡圖（見圖4）。富集數(shù)目較多的為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性（DNAbinding transcription activator activity）、RNA聚合酶Ⅱ特異性（RNA polymeraseⅡ-specific）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity）、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動(dòng)子序列（RNA polymeraseⅡproximal promoter sequencespecific DNA binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、類固醇激素受體（steroid hormone receptor activity）等。推測(cè)附子理中湯可能通過改善以上生物學(xué)過程治療2型糖尿病。

圖4 附子理中湯治療2型糖尿病的GO功能富集分析氣泡圖Figure 4 Bubble map for GO enrichment in Fuzi Lizhong Tang for T2DM

2.5 KEGG通路富集分析使用R語言程序進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)103個(gè)交集靶點(diǎn)基因共影響了120個(gè)通路，將其中結(jié)果顯著性最大的前20條通路制作成條形圖（見圖5）。結(jié)果顯示，附子理中湯影響最顯著的前10條通路包括流體剪切力（fluid shear stress）及動(dòng)脈硬化（atherosclerosis）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcomaassociated herpesvirus infection）、乙型肝炎（hepatitis B）、前列腺癌（prostate cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終末產(chǎn)物及其受體信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、結(jié)腸直腸癌（colorectal cancer）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、細(xì)胞凋亡（apoptosis）、人巨細(xì)胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、胰腺癌（pancreatic cancer），提示附子理中湯可能通過這些通路來治療2型糖尿病。

圖5 附子理中湯治療2型糖尿病的KEGG通路富集條形圖Figure 5 Srip chart for KEGG enrichment in Fuzi Lizhong Tang for T2DM

3 討論

本研究在TSMCP數(shù)據(jù)庫中通過篩選條件，選出附子理中湯候選成分125個(gè)，對(duì)附子理中湯中的候選成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與2型糖尿病的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)取交集后，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)103個(gè)。從藥物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中可知附子理中湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵化合物有槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇等。槲皮素、山柰酚是自然界中常見的黃酮醇類單體，已有研究[6]表明，山柰酚、槲皮素對(duì)小鼠的降血糖、血脂功效和消渴丸相當(dāng)，降糖、降血脂效果明顯。槲皮素可能通過降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，減輕胰島細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮降糖作用[7]，還能通過增強(qiáng)足細(xì)胞nephrin和podocin表達(dá)發(fā)揮對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用[8]；山柰酚通過逆轉(zhuǎn)小鼠肌細(xì)胞和脂肪組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的表達(dá)受損來改善血糖和周圍組織對(duì)胰島素的敏感性[9-10]，還能通過抗氧化、抗炎、抑制醛糖還原酶途徑在一定程度上抑制2型糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生[11]；β-谷甾醇則可能通過激活A(yù)MPK來改善葡萄糖和脂質(zhì)代謝[12]。提示附子理中湯中的關(guān)鍵化合物均能通過多種途徑治療2型糖尿病，即附子理中湯治療2型糖尿病是有多種成分發(fā)揮作用。

通過分析PPI網(wǎng)絡(luò)得到附子理中湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵受體可能是EGFR、ESR1、Fos、NCOA1、PPARG等。EGFR的激活能夠上調(diào)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在糖尿病腎病的發(fā)病中起到關(guān)鍵作用[13]；激活ESR1可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞因子（HGF）和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（MET），從而改善肝脂肪變性和胰島素抵抗[14]；PPARG受體激活能夠增加胰島素敏感性并改善胰島素抵抗，PPARG受體激動(dòng)劑噻唑烷二酮類（TZD）中的羅格列酮、吡格列酮已在臨床作為胰島素增敏劑廣泛使用。提示附子理中湯可以通過激活多個(gè)靶點(diǎn)來治療2型糖尿病。

通過分析GO富集結(jié)果可知，附子理中湯可以不同程度地影響多種生物學(xué)進(jìn)程治療2型糖尿病，如影響基因的轉(zhuǎn)錄、核受體活性以及影響類固醇受體、雌激素受體、核激素受體、乙酰膽堿受體等。核受體是后生動(dòng)物中含量最豐富的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，目前研究表明，核受體紊亂是肥胖病及糖尿病發(fā)病的重要病因[15]；激活雌激素受體能夠有效抑制糖尿病所致的血管內(nèi)皮功能障礙，能夠預(yù)防糖尿病心血管損傷[16]；膽堿能抗炎通路抑制全身性炎癥反應(yīng)從而改善胰島素抵抗、降低血糖[17]。KEGG通路結(jié)果表明，附子理中湯治療2型糖尿病最顯著影響的通路是流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路，該通路包含了P13K/AKt信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路等，這些通路都已被證實(shí)與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)。P13K/Akt信號(hào)通路主要參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及遷徙[18]，目前體內(nèi)外研究表明，糖尿病腎病的發(fā)生與P13K/Akt信號(hào)通路激活相關(guān)[19-20]，MAPK的過度激活則會(huì)加速糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化[21-22]。附子理中湯還可影響TNF、AGERAGE、乙肝病毒、巨細(xì)胞病毒等通路。研究[23]表明，AGE-RAGE通路也與糖尿病大血管病變密切相關(guān)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，AGE與RAGE結(jié)合后可以通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程；大量研究[24]揭示了TNF-α可明顯抑制胰島素的作用，造成胰島素抵抗；乙肝病毒慢性感染已被證實(shí)與肝源性糖尿病發(fā)病相關(guān)[25]；巨細(xì)胞病毒感染也被證實(shí)能夠影響糖尿病患者的空腹血糖，且嚴(yán)重程度與DNA載量相關(guān)[26]。另外，有研究表明2型糖尿病與癌癥相關(guān)，2型糖尿病能顯著增加胰腺癌和結(jié)腸直腸癌的發(fā)病，能減少前列腺癌的發(fā)展[27]，而目前2型糖尿病的一線用藥二甲雙胍則被證實(shí)能降低癌癥死亡率[28]。推測(cè)附子理中湯可能在治療2型糖尿病的同時(shí)，能夠減少癌癥的發(fā)生及死亡率，但目前還缺乏此類研究相關(guān)文獻(xiàn)可以為以后拓展附子理中湯的適應(yīng)范圍提供理論性參考。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)，通過借助相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫及軟件，構(gòu)建了網(wǎng)絡(luò)并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行了富集分析，闡述了附子理中湯治療2型糖尿病的關(guān)鍵化合物、關(guān)鍵蛋白、作用靶點(diǎn)和作用通路之間的關(guān)系。結(jié)果提示，附子理中湯可能以有效成分槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇通過調(diào)控上述靶點(diǎn)、通路起到改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂代謝、降低血糖及預(yù)防并發(fā)癥等的作用。本研究為附子理中湯進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考依據(jù)，但仍存在需要解決的問題，如活性成分篩選標(biāo)準(zhǔn)尚不能做到完全準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)的采集依賴數(shù)據(jù)庫，存在一定的局限性，不能揭示完整的藥理作用。此外，本研究著重于理論，后期需要更多的臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。