反向高效液相色譜法同時測定千斤拔不同種、不同藥用部位中醋酸乙酯部位化學成分的含量

任朝琴，戴先芝，袁瑋，劉圓

（1.阿壩師范學院藏羌醫藥研究所，四川汶川 623000；2.西南民族大學少數民族藥物研究所，四川成都 610041）

《中華人民共和國藥典：一部》（2020年版）中收載千斤拔為豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.etRolfe）Li或大葉千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze的干燥根[1]，具有鎮痛、抗炎作用，可治療婦科病[2]。地方藥用的還有球穗千斤拔Moghania strobilifera（Linn.）Ait.、寬葉千斤拔MoghaniaLatifolia Benth、腺毛千斤拔Moghaniaglutiaosa（Prain）Y.T.Wei.等種。考察不同品種千斤拔的質量對千斤拔產業科學化、可持續化發展具有重要的意義。千斤拔含有黃酮、多糖、生物堿、β-谷甾醇等多種成分的測定已有報道[3]；但尚未有對千斤拔中醋酸乙酯部位化學成分燃料木素（genistein）、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮（2’-hydroxygenistein），3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷（ourateacatechin）含量測定的報道。本研究擬對上述5個不同種的千斤拔不同藥用部位中燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮、3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量進行比較研究，以期尋找到新的藥源，并進一步為臨床上科學、合理和可控地使用該類藥材提供一定的實驗數據。現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器Waters2695高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）；Waters2996檢測器（美國Waters公司）；Empower色譜工作站，色譜柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）（北京迪科馬科技有限公司）；Unicam UV-500（美國Thermo electron公司）；Milli-Q超純水系統儀，KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER AE240電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試劑對照品：燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮、3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷，均為自制[4]，純度分別為99.0%、98.3%、98.5%。甲醇為色譜純（美國迪瑪公司），水為超純水及蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材大葉千斤拔（四川成都）、蔓性千斤拔（湖北宜昌）、球穗千斤拔（廣西舉城）、腺毛千斤拔（廣西）、寬葉千斤拔（廣西），經劉圓教授鑒定為蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.etRolfe）Li、大葉千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze、球 穗 千 斤 拔Moghania strobilifera（Linn.）Ait.、寬葉千斤拔Moghania LatifoliaBenth、腺毛千斤拔Moghania glutiaosa（Prain）Y.T.Wei.的根、莖、葉。

2 方法與結果

2.1 供試液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取“1.2”項中3種對照品，用甲醇稀釋成含燃料木素1.007 52 mg·mL-1、含5，7，2’，4’-四羥基異黃酮1.005 21 mg·mL-1、含3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷1.006 23 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備 按照醋酸乙酯最佳提取工藝制備樣品溶液：料液比為1∶14，提取溫度100℃，提取時間為3 h，水浴回流提取2次。

2.2 色譜條件的選擇經考察，效果最佳的色譜條件：色譜柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸水（23∶77，10 min；43∶57，11～55 min）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：240 nm。HPLC色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Figure 1 HPLC Chromatograms

2.3 線性關系的考察

2.3.1 標準曲線的制備 分別精密量取“2.1.1”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10μL，按“2.2”項色譜條件進行測定，以進樣量（μg）的對數為橫坐標，峰面積值的對數為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3.1.1 燃料木素的標準曲線 按“2.3.1”項方法，得到燃料木素的標準曲線方程為Y=1.011 6X+6.609 7，R2=0.999 6，其線性范圍為2.015 04～10.075 2μg。具體結果見表1。

表1 燃料木素線性關系考察結果Table 1 Investigation result for linear relationship of genistein

2.3.1.2 5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的標準曲線 按“2.3.1”項方法，得到5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的標準曲線方程為Y=1.010 1X+6.486 2，R2=0.999 7，其線性范圍為2.010 42～10.052 10μg。具體結果見表2。

表2 5，7，2’，4’-四羥基異黃酮線性關系考察結果Table 2 Investigation result for linear relationship of 2’-hydroxygenistein

2.3.1.3 3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的標準曲線 按“2.3.1”項方法，得到3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的標準曲線方程為Y=1.006 2X+5.771 9，R2=0.999 7，其線性范圍為2.012 46～10.062 30μg。具體結果見表3。

表3 3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷線性關系考察結果Table 3 Investigation result for linear relationship of ourateacetechin

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液5μL，連續重復進樣6次。結果顯示：燃料木素的相對標準偏差（RSD）為0.82%，5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的RSD為0.75%，3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的RSD為0.83%。表明精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 分別精密稱取千斤拔藥材6份，按照“2.1.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.2”項色譜條件進行測定，結果顯示：燃料木素的RSD為0.87%，5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的RSD為0.82%、3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷峰面積值的RSD為0.97%。表明重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密吸取同一批樣品溶液10μL，按“2.2”項色譜條件于0、2、4、8、12、24 h測定，結果顯示：燃料木素的RSD為0.91%，5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的RSD為0.94%，3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的RSD為1.11%。表明樣品穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取千斤拔藥材2.5 g，共9份，分為3組分別加入混合對照品10、20、30μL，按照“2.1.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.2”項色譜條件進行測定。計算得到9份樣品燃料木素平均回收率為99.75%，RSD為0.92%；5，7，2’，4’-四羥基異黃酮平均回收率為101.24%，RSD為1.13%；3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷平均回收率為102.35%，RSD為1.28%。

2.4 樣品中3種有效成分含量的測定按照醋酸乙酯最佳提取工藝（料液比為1∶14，提取溫度100℃，提取時間為3 h，水浴回流提取2次），以燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮、3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷作為含量評價指標，比較不同種千斤拔的藥材質量。不同種千斤拔測定結果見表4。

表4 千斤拔樣品中3種有效成分含量的測定結果Table 4 Determination result for contents of 3 effective ingredients in various samples （n=3）

3 討論

在本課題組前期對千斤拔進行了大量系統性研究[5-9]的基礎上，本研究對千斤拔的有效部位之一醋酸乙酯部位進行成分分離，得到燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮，3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷3個化合物，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時測定千斤拔中燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮，3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量。本研究建立了千斤拔藥材中有效成分的含量測定方法，方法簡便、準確，重復性好，可用于千斤拔的質量評價方法之一。

不同種千斤拔藥材根部位的比較中：蔓性千斤拔根中所含的燃料木素最高，其次為腺毛千斤拔和寬葉千斤拔，大葉千斤拔含量較低，球穗千斤拔含量最低；5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的含量，仍以蔓性千斤拔根最高，其次為寬葉千斤拔和腺毛千斤拔，大葉千斤拔含量較低，球穗千斤拔最低；3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量，以寬葉千斤拔最高，其次為蔓性千斤拔，大葉千斤拔最低，但在球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未檢測出。

不同種千斤拔藥材莖部位的比較中：蔓性千斤拔莖中所含的燃料木素最高，其次為大葉千斤拔和腺毛千斤拔，寬葉千斤拔含量較低，球穗千斤拔含量最低；5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的含量，以蔓性千斤拔莖最高，其次為寬葉千斤拔和大葉千斤拔，腺毛千斤拔和球穗千斤拔未檢出；3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量，大葉千斤拔最高，其次為蔓性千斤拔，最低為寬葉千斤拔，但在球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未檢測出。

不同種千斤拔藥材葉部位的比較中：蔓性千斤拔葉中所含的燃料木素最高，其次為腺毛千斤拔和寬葉千斤拔，大葉千斤拔和球穗千斤拔未檢出；5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的含量，以蔓性千斤拔莖最高，其次為大葉千斤拔，寬葉千斤拔、腺毛千斤拔和球穗千斤拔未檢出；3，5，7，3’5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量，大葉千斤拔最高，其次為寬葉千斤拔，最低為蔓性千斤拔，球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未檢測出。

本研究測定了蔓性千斤拔、大葉千斤拔、球穗千斤拔、寬葉千斤拔、腺毛千斤拔5個樣品。結果顯示蔓性千斤拔的根、莖在燃料木素和5，7，2’，4’-四羥基異黃酮含量上遠高于其他種，寬葉千斤拔的葉中富含3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷，球穗千斤拔僅根、莖中含有較少的燃料木素。從有效化學成分角度考慮，建議球穗千斤拔不宜替代藥典品種蔓性千斤拔、大葉千斤拔入藥；從有效化學成分資源的綜合及可持續利用角度考慮，建議蔓性千斤拔的莖、葉可以與其根同等入藥。

本研究所用的藥材均是采摘于國內不同地區的野生藥材，很難確定其準確的生長年限。對于同產地、同采收期的千斤拔藥材質量有待進一步研究。

本研究僅對5種千斤拔有效成分進行含量測定來評價藥材質量，尚不夠全面，有待今后進一步從千斤拔中分離出更多的有效成分來全面評價藥材質量。