反向高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定千斤拔不同種、不同藥用部位中醋酸乙酯部位化學(xué)成分的含量

任朝琴，戴先芝，袁瑋，劉圓

（1.阿壩師范學(xué)院藏羌醫(yī)藥研究所，四川汶川 623000；2.西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所，四川成都 610041）

《中華人民共和國(guó)藥典：一部》（2020年版）中收載千斤拔為豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.etRolfe）Li或大葉千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze的干燥根[1]，具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用，可治療婦科病[2]。地方藥用的還有球穗千斤拔Moghania strobilifera（Linn.）Ait.、寬葉千斤拔MoghaniaLatifolia Benth、腺毛千斤拔Moghaniaglutiaosa（Prain）Y.T.Wei.等種。考察不同品種千斤拔的質(zhì)量對(duì)千斤拔產(chǎn)業(yè)科學(xué)化、可持續(xù)化發(fā)展具有重要的意義。千斤拔含有黃酮、多糖、生物堿、β-谷甾醇等多種成分的測(cè)定已有報(bào)道[3]；但尚未有對(duì)千斤拔中醋酸乙酯部位化學(xué)成分燃料木素（genistein）、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮（2’-hydroxygenistein），3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷（ourateacatechin）含量測(cè)定的報(bào)道。本研究擬對(duì)上述5個(gè)不同種的千斤拔不同藥用部位中燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮、3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量進(jìn)行比較研究，以期尋找到新的藥源，并進(jìn)一步為臨床上科學(xué)、合理和可控地使用該類(lèi)藥材提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器Waters2695高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Waters公司）；Waters2996檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；Empower色譜工作站，色譜柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）（北京迪科馬科技有限公司）；Unicam UV-500（美國(guó)Thermo electron公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)儀，KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER AE240電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試劑對(duì)照品：燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮、3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷，均為自制[4]，純度分別為99.0%、98.3%、98.5%。甲醇為色譜純（美國(guó)迪瑪公司），水為超純水及蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材大葉千斤拔（四川成都）、蔓性千斤拔（湖北宜昌）、球穗千斤拔（廣西舉城）、腺毛千斤拔（廣西）、寬葉千斤拔（廣西），經(jīng)劉圓教授鑒定為蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.etRolfe）Li、大葉千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze、球 穗 千 斤 拔Moghania strobilifera（Linn.）Ait.、寬葉千斤拔Moghania LatifoliaBenth、腺毛千斤拔Moghania glutiaosa（Prain）Y.T.Wei.的根、莖、葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取“1.2”項(xiàng)中3種對(duì)照品，用甲醇稀釋成含燃料木素1.007 52 mg·mL-1、含5，7，2’，4’-四羥基異黃酮1.005 21 mg·mL-1、含3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷1.006 23 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備 按照醋酸乙酯最佳提取工藝制備樣品溶液：料液比為1∶14，提取溫度100℃，提取時(shí)間為3 h，水浴回流提取2次。

2.2 色譜條件的選擇經(jīng)考察，效果最佳的色譜條件：色譜柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸水（23∶77，10 min；43∶57，11～55 min）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm。HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Figure 1 HPLC Chromatograms

2.3 線(xiàn)性關(guān)系的考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10μL，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量（μg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3.1.1 燃料木素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 按“2.3.1”項(xiàng)方法，得到燃料木素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=1.011 6X+6.609 7，R2=0.999 6，其線(xiàn)性范圍為2.015 04～10.075 2μg。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 燃料木素線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Investigation result for linear relationship of genistein

2.3.1.2 5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 按“2.3.1”項(xiàng)方法，得到5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=1.010 1X+6.486 2，R2=0.999 7，其線(xiàn)性范圍為2.010 42～10.052 10μg。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5，7，2’，4’-四羥基異黃酮線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果Table 2 Investigation result for linear relationship of 2’-hydroxygenistein

2.3.1.3 3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 按“2.3.1”項(xiàng)方法，得到3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=1.006 2X+5.771 9，R2=0.999 7，其線(xiàn)性范圍為2.012 46～10.062 30μg。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果Table 3 Investigation result for linear relationship of ourateacetechin

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示：燃料木素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.82%，5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的RSD為0.75%，3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的RSD為0.83%。表明精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取千斤拔藥材6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：燃料木素的RSD為0.87%，5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的RSD為0.82%、3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷峰面積值的RSD為0.97%。表明重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批樣品溶液10μL，按“2.2”項(xiàng)色譜條件于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，結(jié)果顯示：燃料木素的RSD為0.91%，5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的RSD為0.94%，3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的RSD為1.11%。表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取千斤拔藥材2.5 g，共9份，分為3組分別加入混合對(duì)照品10、20、30μL，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算得到9份樣品燃料木素平均回收率為99.75%，RSD為0.92%；5，7，2’，4’-四羥基異黃酮平均回收率為101.24%，RSD為1.13%；3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷平均回收率為102.35%，RSD為1.28%。

2.4 樣品中3種有效成分含量的測(cè)定按照醋酸乙酯最佳提取工藝（料液比為1∶14，提取溫度100℃，提取時(shí)間為3 h，水浴回流提取2次），以燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮、3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷作為含量評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較不同種千斤拔的藥材質(zhì)量。不同種千斤拔測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 千斤拔樣品中3種有效成分含量的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination result for contents of 3 effective ingredients in various samples （n=3）

3 討論

在本課題組前期對(duì)千斤拔進(jìn)行了大量系統(tǒng)性研究[5-9]的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)千斤拔的有效部位之一醋酸乙酯部位進(jìn)行成分分離，得到燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮，3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷3個(gè)化合物，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)測(cè)定千斤拔中燃料木素、5，7，2’，4’-四羥基異黃酮，3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量。本研究建立了千斤拔藥材中有效成分的含量測(cè)定方法，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于千斤拔的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法之一。

不同種千斤拔藥材根部位的比較中：蔓性千斤拔根中所含的燃料木素最高，其次為腺毛千斤拔和寬葉千斤拔，大葉千斤拔含量較低，球穗千斤拔含量最低；5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的含量，仍以蔓性千斤拔根最高，其次為寬葉千斤拔和腺毛千斤拔，大葉千斤拔含量較低，球穗千斤拔最低；3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量，以寬葉千斤拔最高，其次為蔓性千斤拔，大葉千斤拔最低，但在球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未檢測(cè)出。

不同種千斤拔藥材莖部位的比較中：蔓性千斤拔莖中所含的燃料木素最高，其次為大葉千斤拔和腺毛千斤拔，寬葉千斤拔含量較低，球穗千斤拔含量最低；5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的含量，以蔓性千斤拔莖最高，其次為寬葉千斤拔和大葉千斤拔，腺毛千斤拔和球穗千斤拔未檢出；3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量，大葉千斤拔最高，其次為蔓性千斤拔，最低為寬葉千斤拔，但在球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未檢測(cè)出。

不同種千斤拔藥材葉部位的比較中：蔓性千斤拔葉中所含的燃料木素最高，其次為腺毛千斤拔和寬葉千斤拔，大葉千斤拔和球穗千斤拔未檢出；5，7，2’，4’-四羥基異黃酮的含量，以蔓性千斤拔莖最高，其次為大葉千斤拔，寬葉千斤拔、腺毛千斤拔和球穗千斤拔未檢出；3，5，7，3’5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷的含量，大葉千斤拔最高，其次為寬葉千斤拔，最低為蔓性千斤拔，球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未檢測(cè)出。

本研究測(cè)定了蔓性千斤拔、大葉千斤拔、球穗千斤拔、寬葉千斤拔、腺毛千斤拔5個(gè)樣品。結(jié)果顯示蔓性千斤拔的根、莖在燃料木素和5，7，2’，4’-四羥基異黃酮含量上遠(yuǎn)高于其他種，寬葉千斤拔的葉中富含3，5，7，3’，5’-五羥基-4’-甲氧基黃烷，球穗千斤拔僅根、莖中含有較少的燃料木素。從有效化學(xué)成分角度考慮，建議球穗千斤拔不宜替代藥典品種蔓性千斤拔、大葉千斤拔入藥；從有效化學(xué)成分資源的綜合及可持續(xù)利用角度考慮，建議蔓性千斤拔的莖、葉可以與其根同等入藥。

本研究所用的藥材均是采摘于國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的野生藥材，很難確定其準(zhǔn)確的生長(zhǎng)年限。對(duì)于同產(chǎn)地、同采收期的千斤拔藥材質(zhì)量有待進(jìn)一步研究。

本研究?jī)H對(duì)5種千斤拔有效成分進(jìn)行含量測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，尚不夠全面，有待今后進(jìn)一步從千斤拔中分離出更多的有效成分來(lái)全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。