索氏提取裝置的改良及其在煙草揮發(fā)性成分分析中的應(yīng)用

黃海濤，許 永，劉 欣，李 晶，孔維松，楊葉昆，李雪梅，楊光宇

（云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650106）

人的嗅覺(jué)和味覺(jué)對(duì)煙草中的揮發(fā)性成分通常比較敏感，而其中許多揮發(fā)性成分是煙草中重要的香氣成分。煙草香氣成分是影響卷煙產(chǎn)品風(fēng)味形成的主要因素,也是評(píng)價(jià)卷煙品質(zhì)的重要因素。因此，揮發(fā)性成分的組成和含量一直是煙草化學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。

目前，常用的揮發(fā)性成分提取方法有溶劑萃取 法[1]、同時(shí)蒸餾萃取法[2-4]、超臨界流體萃取法[5]、固相微萃取法[2-4,6]、頂空氣相色譜法[7]、吹掃捕集熱脫附解吸法[8]等。在這些方法中，頂空氣相色譜法、吹掃捕集熱脫附解吸法因分析結(jié)果重現(xiàn)性較差，大多用于定性分析；同時(shí)蒸餾萃取中部分不穩(wěn)定組分長(zhǎng)時(shí)間與熱水相遇會(huì)發(fā)生熱分解；而溶劑萃取法因操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、提取效率高等得到了廣泛的應(yīng)用。固體物質(zhì)的溶劑萃取通常采用冷浸法或熱浸法（索氏提取法），冷浸法是靠溶劑長(zhǎng)時(shí)間的浸潤(rùn)溶解從而將固體物質(zhì)中可溶于溶劑的成分浸提出來(lái)，而熱浸法（索氏提取法）是利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質(zhì)被純?nèi)軇┏掷m(xù)提取，但在提取過(guò)程中大量雜質(zhì)會(huì)隨揮發(fā)性成分一起溶出，影響樣品分析結(jié)果，而且在提取過(guò)程中很難避免揮發(fā)性成分損失。

綜上所述，現(xiàn)有的方法均無(wú)法滿足煙草中揮發(fā)性成分準(zhǔn)確分析和客觀評(píng)價(jià)的要求。基于此，筆者對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)了一種帶固相萃取功能的索氏提取裝置，該裝置于密閉環(huán)境進(jìn)行加熱萃取，集萃取、凈化和濃縮為一體，中途不需要轉(zhuǎn)移樣品，大大簡(jiǎn)化了樣品前處理操作，有效縮短了樣品前處理周期。該裝置為煙草中揮發(fā)性成分的提取分析提供了快速可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙葉樣品為云煙87，產(chǎn)地玉溪。主要試驗(yàn)試劑有硅膠、硅鎢酸、無(wú)水硫酸鈉和二氯甲烷，除特殊說(shuō)明外，所用試劑均為分析純或以上級(jí)。

主要試驗(yàn)儀器有高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、Agilent 6890-5973N 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）、ME414S 型電子天平（感量0.0001g，德國(guó)Sartorius 公司）、SJIA-5FE 小型視頻冷凍干燥機(jī)（寧波雙嘉）。

1.2 傳統(tǒng)索氏提取裝置的改良

該研究設(shè)計(jì)的帶固相萃取功能的索氏提取裝置（圖1）包括如下部件：燒瓶1，燒瓶1 上設(shè)有第一接口3、第二接口4 和螺紋接口2，燒瓶1 通過(guò)第一接口3 與隔熱導(dǎo)氣管5 氣流導(dǎo)通連接，隔熱導(dǎo)氣管5 另一端與三通轉(zhuǎn)接管7 氣流導(dǎo)通連接，三通轉(zhuǎn)接管7 的另外2 個(gè)接口分別與密閉冷凝管10 和樣品筒8 氣流導(dǎo)通連接，密閉冷凝管10 上設(shè)有泄壓閥11，樣品筒8 遠(yuǎn)離三通轉(zhuǎn)接管7 的一端設(shè)有篩板12，并與固相萃取柱9 氣流導(dǎo)通連接，固相萃取柱9 的另一端通過(guò)溶劑回流管6 與第二接口4 氣流導(dǎo)通連接，溶劑回流管6 內(nèi)設(shè)有三通閥13；當(dāng)樣品處理完畢，螺紋接口2 可與樣品接收尾管15 相連。

圖1 帶固相萃取功能的索氏提取裝置結(jié)構(gòu)

帶固相萃取功能的索氏提取裝置工作過(guò)程如下：樣品分析時(shí)，于固相萃取柱9 中加入硅膠顆粒和硅鎢酸，在樣品筒8 中裝入稱(chēng)量好的樣品，在樣品上方覆蓋一層無(wú)水硫酸鈉（用于除去溶劑及管道內(nèi)的水分），將樣品筒8 與固相萃取柱9 密封連接，在燒瓶1 中加入回流提取的溶劑（二氯甲烷），將固相萃取柱9 通過(guò)溶劑回流管6 與第二接口4 密封連接，將隔熱導(dǎo)氣管5 與第一接口3 密封連接，將三通轉(zhuǎn)接管7 的3 個(gè)接口分別與樣品筒8、密封冷凝管10 和隔熱導(dǎo)氣管5密封連接，密封冷凝管10 接通冷凝水，最后將燒瓶1置于水浴鍋或油浴鍋中加熱冷凝回流。樣品提取過(guò)程中，溶劑回流管6 的三通閥13 與第二接口4 氣流導(dǎo)通，揮發(fā)的溶劑將固相萃取柱9 中所提取的待測(cè)樣品回流至燒瓶1 中，當(dāng)樣品提取完畢后，把三通閥13 調(diào)整為與外界空氣導(dǎo)通的狀態(tài)，不斷揮發(fā)的溶劑通過(guò)三通閥13 流出并回收，此時(shí)燒瓶1 中的溶液不斷被濃縮直至溶劑蒸發(fā)完，即可進(jìn)行色譜檢測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理方法優(yōu)化 于固相萃取柱9 內(nèi)填充一定量（10、20、30、40 g）硅膠顆粒（30～60 μm）和一定量（2、5、10 g）硅鎢酸，然后于樣品筒8 中稱(chēng)取待測(cè)樣品20.0 g，在樣品上方覆蓋一層無(wú)水硫酸鈉（用于除去溶劑及管道內(nèi)的水分）；將放置有樣品的樣品筒8 與帶有固相萃取功能的索氏提取裝置的其他部分密封連接；于燒瓶1中加入200 mL提取溶劑（乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷[9-10]），然后將上述裝置放入50℃水浴鍋中加熱回流一定時(shí)間（1、2、3、4、5 h）。樣品提取完畢后，打開(kāi)三通閥13，讓溶劑從溶劑回收口流出回收溶劑，直至燒瓶1 所連接的樣品接收尾管中的樣品溶液蒸發(fā)至約1 mL，濃縮好的樣品準(zhǔn)確定容到5.0 mL，用0.45 μm 的針頭過(guò)濾器過(guò)濾，濾液進(jìn)行GC-MS 分析。

1.3.2 色譜條件優(yōu)化 （1）色譜條件1：DB-5 MS 色譜 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn) 樣 量2.0 μL；柱流量1.0 mL/min；分流比20 ∶1；進(jìn)樣口溫度260℃；程序升溫條件為初始溫度50℃保持5 min，再以3℃/min 速率升至230℃保持5 min，再以10℃/min 速率升至260℃保持20 min。（2）色譜條件2：DB-5 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣量2.0 μL；柱流量1.0 mL/min；分流比1 ∶1；進(jìn)樣口溫度260℃；程序升溫條件為初始溫度50℃保持2 min，再以5℃/min 速率升至220℃，再以10℃/min 速率升至250℃保持10 min。

1.3.3 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源E1，離子化電壓70 eV，離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍40～450 amu。

1.3.4 3 種裝置提取效果的比較 采用該研究設(shè)計(jì)的帶固相萃取功能的索氏提取裝置、傳統(tǒng)的索氏提取裝置以及同時(shí)蒸餾萃取裝置分別提取煙草樣品中的揮發(fā)性成分，對(duì)3 種提取樣品色譜圖中峰面積最大的22種組分進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 最佳提取試劑 采用該研究設(shè)計(jì)的帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取煙葉樣品，分別用乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷3 種不同極性的溶劑提取，對(duì)比分析提取液的 GC-MS 總離子流圖發(fā)現(xiàn)，3 種提取試劑中，二氯甲烷提取液中的化學(xué)成分種類(lèi)最多，色譜峰面積較大，故后續(xù)研究選用二氯甲烷作為提取試劑。

2.1.2 最適提取時(shí)間 按照1.3.1 的樣品前處理方法，采用帶固相萃取功能的索氏提取裝置分別提取煙葉樣品1、2、3、4、5 h，對(duì)比分析不同提取時(shí)間得到的提取液的GC-MS 總離子流圖發(fā)現(xiàn)，提取2 h 后，總離子流圖中化學(xué)成分種類(lèi)及色譜峰面積變化不大。因此，為保證目標(biāo)物提取完全，后續(xù)研究選擇的提取時(shí)間為2.5 h。

2.1.3 固相萃取填料的最佳用量 （1）硅膠顆粒最佳用量：索氏提取法在提取過(guò)程中大量雜質(zhì)會(huì)隨揮發(fā)性成分一起溶出，因此該研究對(duì)傳統(tǒng)索氏提取裝置進(jìn)行了改進(jìn)，于索氏提取裝置中增設(shè)了固相萃取柱，采用硅膠作為固相萃取填料以吸附提取液中的極性雜質(zhì)，并對(duì)硅膠的用量進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)硅膠用量為10 g 時(shí)，提取液總離子流圖中化學(xué)成分種類(lèi)明顯多于另外3 種硅膠用量，可能是由于硅膠用量較大時(shí)吸附了部分揮發(fā)性成分。為了實(shí)現(xiàn)提取液的有效凈化，該研究選用10 g 硅膠對(duì)提取液中的極性雜質(zhì)進(jìn)行吸附。（2）硅鎢酸最佳用量：在煙草揮發(fā)性成分的提取過(guò)程中煙堿會(huì)隨著揮發(fā)性成分一起溶出，由于煙堿的含量明顯高于其他揮發(fā)性成分，在色譜圖上煙堿的色譜峰會(huì)顯著影響出峰位置與其接近的部分揮發(fā)性成分的測(cè)定，因此該研究于固相萃取柱中放置硅鎢酸以除去生物堿的干擾，并對(duì)硅鎢酸的用量進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：當(dāng)硅鎢酸用量為2 g 時(shí)，提取液總離子流圖中煙堿仍有明顯出峰；當(dāng)硅鎢酸用量為5 和10 g 時(shí)，提取液總離子流圖中均未出現(xiàn)煙堿的色譜峰；但硅鎢酸用量為10 g 時(shí)，提取液總離子流圖中化學(xué)成分種類(lèi)少于5 g 硅鎢酸用量的，可能是由于硅鎢酸用量較大時(shí)吸附了部分揮發(fā)性成分。為了實(shí)現(xiàn)煙堿的有效吸附，該研究選用5 g 硅鎢酸作為煙堿吸附劑。

2.1.4 最佳色譜條件 由表1 可知，采用色譜條件1分離得到的色譜圖上煙草揮發(fā)性成分更多，色譜峰的分離度更好。

2.2 煙草揮發(fā)性成分分析

從表1 中色譜條件1 的分析數(shù)據(jù)可以看出，采用帶固相萃取功能的索氏提取裝置，在優(yōu)化后的試驗(yàn)條件下對(duì)煙草樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，檢測(cè)到酮類(lèi)化合物16 種（包括巨豆三烯酮4 種）、醇類(lèi)化合物9 種、酯類(lèi)化合物9 種、烯類(lèi)化合物7 種、酸類(lèi)化合物6 種、醛類(lèi)化合物2 種、酚類(lèi)化合物2 種、其他化合物6 種。其中相對(duì)含量較高的是烯類(lèi)化合物（33.95%）和酸類(lèi)化合物（32.25%），隨后依次是其他化合物（17.72%）、醇類(lèi)化合物（11.93%）、酮類(lèi)化合物（2.77%）和酯類(lèi)化合物（0.98%），含量較低的是酚類(lèi)化合物（0.33%）和醛類(lèi)化合物（0.07%）。

表1 不同色譜條件下煙草揮發(fā)性成分分析結(jié)果

續(xù)表1

2.3 不同提取裝置對(duì)煙草樣品中主要揮發(fā)性成分的提取效果

從表2 可以看出，傳統(tǒng)索氏提取裝置提取液的色譜圖中煙堿峰面積最大，同時(shí)蒸餾萃取裝置提取液的色譜圖中煙堿峰面積明顯小于傳統(tǒng)索氏提取裝置，而該研究設(shè)計(jì)的帶固相萃取功能的索氏提取裝置的提取液中未檢測(cè)到煙堿。由此可見(jiàn)，帶固相萃取功能的索氏提取裝置能夠完全吸附提取液中的煙堿，從而有效去除煙堿對(duì)揮發(fā)性成分分析的干擾。3 種裝置獲得的提取液中都檢測(cè)到的組分有巨豆三烯酮（A、B、C、D）、新植二烯、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸和（Z,Z,Z）-9,12,15-十八碳三烯酸，而且?guī)Ч滔噍腿」δ艿乃魇咸崛⊙b置的提取液中這幾種組分的色譜峰面積均明顯大于其他2 種提取裝置。同時(shí)蒸餾萃取裝置和帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取液中都檢測(cè)到的組分有2,2,4,6,6-五甲基-庚烷、香葉基香葉醇和亞麻酸甲酯，其中帶固相萃取功能的索氏提取裝置的提取液中這幾種組分的色譜峰面積均大于同時(shí)蒸餾萃取裝置的。傳統(tǒng)索氏提取裝置和帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取液中都檢測(cè)到的組分有3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇，其中帶固相萃取功能的索氏提取裝置的提取液中的色譜峰面積大于傳統(tǒng)索氏提取裝置。

表2 3 種裝置提取煙草中主要揮發(fā)性成分的結(jié)果

此外，帶固相萃取功能的索氏提取裝置提取液中檢出了10 種另外2 種裝置未提取到的化合物，分別為苯甲醇、2-乙酰基吡咯、苯乙醇、α-松油醇、大馬士酮、對(duì)甲基苯乙酮、5-羥基-3-甲基-1-茚滿酮、（R）-5,6,7,7a-四氫-4,4,7a-三甲基-2（4H）-苯并呋喃酮、丙酸香茅酯和異植醇。其中大部分物質(zhì)是煙草中主要的致香成分及常用的食用香精香料，例如：苯甲醇是極有用的定香劑，是茉莉、月下香、伊蘭等香精調(diào)配時(shí)不可缺少的香料；2-乙酰基吡咯具有核桃、甘草、烤面包、炒榛子和魚(yú)樣的香氣，可用于食用香精的調(diào)配；苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香，主要用以配制蜂蜜、面包、桃子和漿果等類(lèi)型香精，也可用于調(diào)配玫瑰花香型精油和各種花香型香精；α-松油醇具有丁香味，是調(diào)配紫丁香型香精的主劑；大馬士酮具有強(qiáng)烈的玫瑰類(lèi)似芳香，可用于高級(jí)玫瑰系列化妝品調(diào)制；對(duì)甲基苯乙酮具有類(lèi)似山查子花的芳香，并有類(lèi)似紫苜蓿、蜂蜜、草莓的香味，花果香味尖銳而帶甜，可微量用于杏仁、香莢蘭豆香型的食用香精中，還可少量用于煙草香精中；（R）-5,6,7,7a-四氫-4,4,7a-三甲基-2（4H）-苯并呋喃酮帶有香豆素樣香氣，并有麝香樣氣息，可以用來(lái)調(diào)配煙用香精；丙酸香茅酯具新鮮的果香和玫瑰樣香氣，可用于花香型日用香精和果香型食用香精調(diào)制。

3 結(jié)論與討論

該研究設(shè)計(jì)的帶固相萃取功能的索氏提取裝置可在密閉條件下對(duì)樣品進(jìn)行分離、提純、濃縮，無(wú)需像傳統(tǒng)的分離提純、濃縮需要多次轉(zhuǎn)移、濃縮的操作步驟，大大提高了提取效率；此外，該裝置采用全封閉的冷凝管，有效避免了提取溶劑的揮發(fā)損失，大大降低了樣品前處理過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境造成的污染；密閉冷凝器帶有泄壓閥，壓力過(guò)高時(shí)可自動(dòng)泄壓，有效避免了可能因壓力過(guò)高對(duì)提取裝置造成的損壞；該裝置在溶劑回流管中設(shè)置三通閥，通過(guò)切換閥門(mén)可直接切換樣品回流提取和濃縮，整個(gè)操作流程不需要轉(zhuǎn)移樣品；該裝置還設(shè)計(jì)了連接樣品接收尾管接口的圓底燒瓶，樣品濃縮完成后，旋下樣品接收尾管即可定容，節(jié)省了常規(guī)濃縮燒瓶濃縮完后，需用吸管把燒瓶中的溶液取出至尾管并洗滌燒瓶和吸管的步驟；針對(duì)煙草樣品中生物堿含量高的特點(diǎn)，該裝置還針對(duì)性的設(shè)計(jì)了帶硅膠和硅鎢酸的復(fù)合固相萃取柱，在樣品提取過(guò)程中即可在線去除生物堿和其他大極性成分的干擾，與傳統(tǒng)的同時(shí)蒸餾萃取測(cè)定揮發(fā)性成分時(shí)需先用酸萃取洗滌除去生物堿以后再進(jìn)行樣品濃縮的步驟相比，該裝置大大簡(jiǎn)化了樣品前處理操作，縮短了樣品前處理時(shí)間。

比較了帶固相萃取功能的索氏提取裝置、傳統(tǒng)的索氏提取裝置以及同時(shí)蒸餾萃取裝置3 種提取方法，發(fā)現(xiàn)提取到的煙草樣品揮發(fā)性成分差異較大。其中，帶固相萃取功能的索氏提取裝置能夠完全吸附提取液中的煙堿，從而有效去除煙堿對(duì)揮發(fā)性成分分析的干擾。而且，帶固相萃取功能的索氏提取裝置對(duì)煙草樣品中部分重要致香成分的提取效果明顯優(yōu)于同時(shí)蒸餾萃取裝置和傳統(tǒng)索氏提取裝置。該裝置的設(shè)計(jì)以及其配套提取方法的建立為煙草中揮發(fā)性成分的提取檢測(cè)分析提供了快速可靠的方法。