豬糞堆肥過程中可培養耐藥菌的抗性研究

王 瑤,馬廣玉，溫沁雪，馬 放,陳志強

(1.哈爾濱工業大學 環境學院,哈爾濱 150090;2.中日友好環境保護中心，北京 100029)

近年來，對于畜禽產品的需求不斷擴大，集約化養殖場為提高畜禽生長和預防畜禽疾病，大量使用獸用抗生素添加劑，30%～90%的抗生素都會通過畜禽的糞便和尿液而排出體外[1].過量使用獸用抗生素可能引起畜禽腸道細菌染色體突變或已有抗性基因被細菌移動元件捕獲，畜禽糞便除有抗生素殘留外，還攜帶抗性細菌及抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)[2].長期施用未被處理的畜禽糞便容易造成環境中抗性細菌的增多，而這些抗性細菌攜帶的抗生素抗性基因通過水平轉移(horizontal gene transfer，HGT)在環境中傳播，導致環境中的病原菌對抗生素的抗性增強，從而威脅人類的健康.

在中國的北方地區，畜禽糞便中檢出率最高的抗生素是四環素類，其次是喹諾酮類、磺胺類和大環內酯類[3].研究表明，堆肥是一種有效削減糞便中抗生素、ARGs和病原菌的有效方式.Chen等[4]研究表明，金霉素、磺胺甲基嘧啶、恩諾沙星和紅霉素在堆肥結束時全部降解.Zaleski等[5]研究牛糞堆肥時發現，90%以上的大腸桿菌和沙門氏菌在10 d以內滅活，李氏桿菌在堆肥14 d后檢測不到[6].

目前，中國養殖場豬糞多是經堆肥后回用于農田，堆肥產品中的耐藥菌也進入土壤環境，糞便堆肥產品中未被消滅的致病性耐藥菌依然會對土著微生物造成危害[7]，現階段仍缺乏堆肥產品中耐藥病原微生物的研究.因此，對于豬糞及其堆肥產品中耐藥細菌的種類、數量和分布的探究為評價糞源有機肥料的環境風險提供重要理論依據.本試驗采微生物培養、微量肉湯稀釋法和細菌16S rDNA分子鑒定等方法，對從養豬場的豬糞及外源添加不同初始濃度金霉素的豬糞堆肥樣品中篩選可培養的抗生素抗性細菌，并通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫的比對，鑒定所篩選抗生素抗性細菌的種類，并對細菌的耐藥性及分布規律進行研究，并通過對豬糞及其堆肥產品中可培養耐藥菌的對比研究，揭示堆肥對耐藥細菌的影響及潛在環境危害.

1 實 驗

1.1 實驗樣品的收集

實驗所需的母豬糞取自哈爾濱的養豬場，堆肥樣品來源于實驗室前期進行的外源添加不同初始濃度金霉素的豬糞堆肥結束時的堆肥產品，對照組CK初始金霉素(chlortetracycline,CTC)殘留量為(0.71±0.02)mg/kg，P1組初始CTC殘留量為(20.27±3.01)mg/kg，P2組初始CTC的殘留量為(101.35±7.07)mg/kg.采集的豬糞及其堆肥產品分兩部分保存，一部分置于4 ℃冰箱保存，用于可培養抗生素抗性細菌的篩選、藥物檢測及常規理化性質的檢測；另一部分置于-20 ℃冰箱保存，用于獸用抗生素的檢測.

1.2 培養基的制備

LB液體培養基：含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g NaCl，以蒸餾水定容至1 L，pH為7.0，于121 ℃滅菌20 min，備用.

LB固體培養基：含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g NaCl，15 g瓊脂粉，以蒸餾水定容至1 L，pH為7.0，于121 ℃滅菌20 min，備用.

麥康凱瓊脂培養基：購置于中國青島海博生物公司，稱取50.0 g麥康凱瓊脂培養基粉末，以蒸餾水定容至1 L，pH為7.0，于105Pa、121 ℃滅菌15 min，備用.

1.3 可培養細菌的分離純化

分別從每個樣品稀釋平板上隨機挑取單菌落，在平板上劃線挑取單菌落，再次劃線，經過3次純化，保證得到單一純化的菌株.純化的菌株分別接種到LB液體培養基上，于37 ℃、220 r/min培養24 h，按20%的比例加入適量甘油，置-20 ℃冰箱保存菌種.

1.4 可培養細菌的計數

取5 g豬糞和堆肥樣品置于三角瓶中，加入45 mL的滅菌生理鹽水(0.85%)，在200 r/min振蕩器振蕩20 min，震蕩結束后靜置5 min，分別吸取1 mL樣品置于滅菌的且含9 mL生理鹽水的試管中，依次稀釋到10-1～10-6.取混勻后稀釋的10-4樣品100 μL涂布于瓊脂平板上，以平板上150～200個菌落為標準，確定稀釋梯度.作3個平行.37 ℃于培養箱中倒置培養36 h.36 h后平板上長出細菌后即可進行計數.

1.5 耐藥細菌計數

取混勻后稀釋的10-4濃度的樣品分別均勻涂布在含有CTC終質量濃度為 30 μg/mL、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine,SMZ)終質量濃度為10 μg/mL、恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)終質量濃度為10 μg/mL、紅霉素(Erythromycin,ERY)終質量濃度為8 μg/mL的抗性平板.另取100 μL對上述4種抗生素均無抗性的大腸桿菌(DH5α)分別涂布在每種抗生素抗性平板上，作為陰性對照.

1.6 DNA提取方法

篩選的細菌基因組提取使用E.Z.N.A? Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek,USA)，按照其說明操作，用NanoDrop 8000高通量分光光度計(NanoDrop Technologies,Germany)測定DNA濃度和純度.DNA于-20 ℃冰箱保存備用.

1.7 微量肉湯稀釋法測定MIC值

實驗用組合式藥敏MIC&MBC測試盒(凍干型)購置于天津市金章科技有限公司，操作方法按照其說明書進行.選取常用的獸用抗生素，阿莫西林/克拉維酸(Amoxicillin/clavulanic acid，AMO)、環丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、ENR、ERY、SMZ、四環素(Tetracycline，TET)、CTC和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(Trimethoprim/sulfamethoxazole，TMP)這8種抗生素進行實驗.用微量移液器按照100 μL/孔的量取0.5麥氏濃度的菌液加入藥敏板中，使菌液最終接種濃度約為105CFU/mL，蓋上無菌蓋.菌液接種完成后，將藥敏板置于墊有濕紗布的瓷盤內，放置于35 ℃恒溫箱中孵育16～24 h.觀察平板菌落的生長情況并計數.抗生素儲備液的質量濃度如表1所示.

表1 抗生素儲備液質量濃度稀釋[8-10]

1.8 可培養耐藥細菌16S rRNA的PCR擴增

以提取的糞便和堆肥中可培養耐藥細菌的基因組為模板，用通用引物27F/1492R(見表2)進行PCR擴增細菌.PCR的反應條件為：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環25次;72 ℃延伸10 min.所得擴增的產物經純化后到生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，獲得的序列在NCBI數據庫中進行BLAST序列比對，篩選同源序列.將分離純化的16S rRNA基因序列與下載的同源序列通過MEGA 4.0軟件進行完全比對.

表2 16S rRNA引物序列及退火溫度

2 結果與分析

2.1 豬糞及其堆肥樣品中可培養細菌計數

豬糞樣品中可培養細菌菌落數為1.05×1010CFU/g(干質量)，堆肥第1天CK、P1和P2樣品中可培養細菌菌落數分別為2.48×109,4.29×109和4.19×109CFU/g，明顯低于糞便樣品中的可培養細菌菌落數.在堆肥升溫期，第1～第4天溫度由35 ℃升高到50 ℃，嗜溫菌活躍，堆體CK、P1和P2可培養菌落數迅速升高.如圖1所示，高溫期(第9～28天)時，由于糞便中的大多病原微生物被殺滅，堆體CK、P1和P2的可培養細菌菌落數下降明顯.隨后，堆肥進入降溫期，在第44天時，堆體溫度降到44 ℃，此時嗜溫菌再次活躍，繼續分解難降解有機物，使可培養細菌菌落數有所升高.隨著溫度逐漸降低并趨于穩定及腐殖質的形成，可培養細菌菌落數也逐漸趨于穩定.堆肥結束時，CK、P1和P2中可培養細菌菌落數分別為4.88×109，6.25×109和5.31×109CFU/g.

圖1 堆肥過程可培養細菌數量的變化

2.2 糞便及堆肥樣品中可培養耐藥菌細菌計數

本研究中的豬糞樣品除了含有CTC，還檢測到了ENR、ERY和SMZ藥物殘留.由圖2可知，經過高溫堆肥后，只有ENR耐藥菌數量增加了，CK、P1和P2堆體分別增加了0.71log、1.43log和0.57log.CK、P1和P2堆肥的CTC耐藥菌分別削減了0.66log、0.45log和1.03log.CK、P1和P2堆肥的ERY耐藥菌分別削減了0.46log、0.67log和0.60log.CK、P1和P2堆肥的SMZ耐藥菌分別削減了0.76log、0.66log和0.67log.由圖2(a)可知，ENR耐藥菌數量在堆肥的高溫期(第4～28天)迅速升高，這表明ENR耐藥菌屬于嗜熱菌，而在降溫期和腐熟期其數量緩慢下降，直至堆肥結束，其數量保持穩定.堆肥過程中CTC耐藥菌數量是4種耐藥菌中最低的，這可能是由于CTC的殺菌效果好導致其耐藥菌數量少.說明堆肥對于SMZ、ERY和CTC耐藥菌的削減是非常有效的.

圖2 堆肥過程中可培養耐藥細菌的變化

在堆肥的升溫期(第1～4天)，CTC殘留量緩慢降低，堆體CK中CTC在第4天全部降解.升溫期的CTC、ERY和SMZ抗性細菌與可培養細菌菌落數比值是逐漸升高的(圖3)，表明這3種耐藥菌中的嗜溫菌在堆肥升溫期極為活躍，促使堆肥溫度不斷上升.在堆肥高溫期(第4～28天)，堆體P1和P2中的CTC質量濃度迅速下降，堆體P1中的CTC在第28天全部降解.高溫期的CTC、ERY和SMZ抗性細菌與可培養細菌菌落數比值迅速下降，表明這3種耐藥菌中的嗜溫菌受高溫的抑制作用而衰亡或休眠，但ENR耐藥菌與可培養細菌菌落數比值明顯升高，說明本研究的堆肥過程中ENR耐藥細菌大多是促進堆肥迅速進入高溫期的嗜熱菌，在高溫階段起主要作用.堆肥的降溫期(第28～59天)，堆體P2中的CTC殘留量緩慢下降，直至第44天CTC全部降解.降溫期的CTC、ERY和SMZ抗性細菌與可培養細菌菌落數比值稍有波動，但變化不大，而此時ENR耐藥菌與可培養細菌菌落數比值迅速下降，這是由于溫度的下降導致嗜溫菌重新復蘇，開始活躍，而ENR耐藥菌多為嗜熱菌，溫度下降對ENR耐藥菌與可培養細菌菌落數的比值影響較大.在堆肥的腐熟期(第59～113天)，CTC、ERY、ENR和SMZ抗性細菌與可培養細菌菌落數比值逐漸趨于穩定，變化不大.堆肥結束后，CTC、ERY、ENR和SMZ抗性細菌占可培養菌落數百分比分別為0.03%～0.06%、10.49%～17.73%、0.46%～0.76%和8.38%～16.52%.

如表3所示，溫度與CTC耐藥菌數量(0.01

圖3 堆肥過程中可培養耐藥菌占可培養細菌菌落數比例變化

表3 耐藥菌數量、CTC濃度和溫度之間的相關性分析

2.3 豬糞及其堆肥產品中可培養耐藥菌株的篩選

豬糞中的病原菌和有害微生物經高溫好氧堆肥被殺死，在堆肥過程中逐漸形成新的穩定的、營養較高的腐殖質.而堆肥產品將直接施用于土壤中，用以提高有機質、氮、磷、鉀等養分，促進農作物的生長，從而達到提高土壤肥力的效果.采用LB培養基和麥康凱培養基(MAC)篩選豬糞及其堆肥產品中的可培養耐藥細菌共88株.如圖4所示，LB培養基篩選出49株CTC耐藥菌，MAC培養基篩選出39株CTC耐藥菌.LB培養基中篩選出1株鶉雞腸球菌和1株糞腸球菌，而MAC培養基中沒有篩選出腸球菌，這是由于腸球菌屬于革蘭陽性(G+)球菌，MAC培養基中的膽酸鹽能抑制革蘭氏陽性(G+)菌生長，更有利于大腸桿菌的篩選.由圖4可知，堆肥產品P2中篩選出的可培養CTC耐藥菌株數明顯小于豬糞、CK堆肥產品和P1堆肥產品.這可能是由于P2堆肥初始時CTC的殘留量為(101.35±7.07)mg/kg，遠大于CK((0.71±0.02)mg/kg)和P1((20.27±3.01)mg/kg)，但是初始P2堆肥中高濃度的CTC對微生物的抑制(殺菌)作用較為明顯，隨著堆肥不斷腐熟，CTC在堆肥降溫期降解完全，抗生素的壓力逐漸減小，堆肥的高溫階段對可培養CTC耐藥菌(圖2(a))及其與總可培養細菌數量比值(圖3(a))的削減較為明顯，以致堆肥P2的可培養CTC耐藥菌數量及其與總可培養細菌數量的比值均小于CK和P1，這些因素導致堆肥結束時P2堆肥中可培養CTC耐藥菌數量較低.由圖4可以看出，無論是LB培養基還是MAC培養，P1和P2堆肥產品并沒有檢測到弗格森埃希菌，而在豬糞樣品和CK堆肥產品中檢測到可培養的弗格森埃希菌，這可能是由P1和P2堆肥中初始CTC濃度高于CK，導致CTC對弗格森埃希菌的抑制作用較大而造成的.

2.4 耐藥菌的最小抑制濃度(MIC)及其對環境的影響

對已篩選出的 88 株CTC耐藥菌進行測序和比對，剔除重復的菌后，有25株不同的CTC耐藥菌，分布在4個不同的屬，6個不同的種，根據美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的標準將篩選的耐藥細菌進行敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)分類[8-10]，表4為抗生素抗性檢測統計結果.

圖4 可培養金霉素耐藥細菌的篩選

表4 抗生素抗性檢測統計結果

本研究中沒有TMP耐藥菌，這可能是由于取的豬糞源于飼料或治療用TMP量較少的豬中.而對于SMZ，只有菌C4是SMZ的耐藥菌，其他菌株都對SMZ敏感.由表3可知，CTC和TET兩種藥物的耐藥菌分別為23株和20株.ERY屬于大環內酯類抗生素，菌EGS、E6、E7是ERY的耐藥菌，有11株菌對ERY是敏感的.ENR的耐藥菌有5株，有15株對ENR是中度敏感.CIP的耐藥菌有4株，敏感的菌株有19株.AMO的耐藥菌僅有E15 1株，其他大部分是對AMO敏感的菌株.

對于3種及3種以上抗生素有抗性的菌是多重耐藥菌.本研究中多重耐藥菌的檢出率為20%.其中，菌C4、E4和E15是對3種抗生素具有耐藥性的菌.檢出的多重耐藥菌包括鶉雞腸球菌和腸桿菌兩類.菌E6和E7都對CTC、TET、ERY、ENR和CIP這5種抗生素具有抗性.三重耐藥菌C4來源于豬糞和CK堆肥產品，而在P1和P2堆肥產品中并沒有篩選到，這表明初始含20和100 mg/kg CTC的豬糞堆肥過程對菌C4的去除是有效果的.三重耐藥菌E15僅來源于豬糞樣品，在堆肥樣品CK、P1和P2中并未檢測到，這說明高溫好氧堆肥對于菌E15有效削減.三重耐藥菌E4和五重耐藥菌E7來源于豬糞樣品與CK、P1和P2堆肥產品，這表明堆肥過程并沒有對菌E4和E7起到削減作用.

3 討 論

微生物在好氧堆肥過程中起著重要的作用，而在堆肥的各個階段中細菌最普遍、數量最多[11-12].在堆肥第9天溫度達到60 ℃，而第9～28天是堆體CK、P1和P2的高溫期，溫度均>55 ℃超過7 d，符合國家的GB7959—87《糞便無害化處理衛生要求》.由于嗜溫菌因堆肥高溫期溫度較高而休眠或死亡，嗜熱微生物迅速繁殖成為優勢菌群，分解半纖維素、纖維素等難分解物質，同時，大多數病原菌被殺死，達到堆肥的無害化[13].堆肥第1天，堆體CK中可培養細菌的數量比P1和P2堆體少，可能是由于初始糞便樣品中含有的可培養細菌不均勻.堆體P1中CTC在第28天全部降解完全，而堆體P2中CTC在第44天全部降解完全.因此，抗生素在堆肥降溫期和腐熟期時對可培養細菌的選擇性壓力消失.在第59～113天，堆體CK中可培養細菌數量比堆體P1和P2中少，這可能是經過堆肥高溫期后，含有較高濃度的CTC堆體對可培養的嗜溫菌起到了富集作用， 堆體P1和P2在堆肥降溫期和腐熟期時可培養細菌數量要高于堆體CK.已有研究表明，牛糞和秸稈堆肥腐熟期時，含有高濃度土霉素的堆體在堆肥腐熟期，存在更多數量的可培養細菌[14].這與本研究結果相似.

已有多項研究表明，導致畜禽糞便存在多種抗生素的耐藥菌[15]，其主要原因一方面是過量未被畜禽吸收而通過尿液和糞便代謝到環境中的抗生素對腸道細菌的篩選，而不耐受抗生素的部分腸道細菌被“淘汰”；另一方面是畜禽長期食用和治療用抗生素的選擇壓力使其腸道細菌產生耐藥性[16].本研究中的堆肥產品源于初始含CTC的豬糞堆肥，而且豬糞樣品中殘留ENR、ERY和SMZ，所以，以篩選可培養CTC耐藥菌為主，展開多重耐藥性的研究.

TMP和SMZ屬于磺胺類藥，是廣譜類的抑菌劑，被用于治療畜禽疾病或者是動物飼料添加劑而添加到畜禽飼料中[17].本研究的抗生素抗性檢測統計結果表明所篩選25株細菌對TMP都是敏感的，而沒有呈現耐藥菌株.ARG發生的HGT，是由腸桿菌在一些獸用抗生素的選擇性壓力下而產生的[18].環境中的低濃度TMP和SMZ對這些敏感性菌株影響較大，長期的抗生素刺激下會使敏感菌株轉化成耐藥菌株.然而，已有研究表明，畜禽養殖場中TMP和黏菌素等多種抗生素的耐藥性逐年增加[19].鶉雞腸球菌屬于糞腸球菌屬，而糞腸球菌屬為重要的醫院感染病原菌之一[20].隨著抗菌藥物的不斷應用，獲得性的耐藥腸球菌菌株在不斷增加.由大腸桿菌引發的畜禽疾病是養殖場中最具危害的常見病和多發病，甚至是引起仔豬疫病發病率和死亡率最高的病原菌[21].

大腸桿菌產生耐藥性主要通過主動外排作用、ARG的HGT和改變外膜蛋白而產生[22].王永芬等[23]研究表明，在臨床上常用獸用抗生素對于豬源致病性大腸桿菌都會產生耐藥性，耐受5種以上抗生素的耐藥菌株占60%之多，而新型抗菌藥對致病大腸桿菌產生的耐藥率也高達40%.由于多重耐藥大腸桿菌E4和E7在堆肥結束后依舊存在于堆肥產品中，當環境中存在低濃度的多重抗生素時，多重耐藥菌在多重抗生素的長期脅迫下會產生多重ARG.已有研究表明，抗生素的亞MIC不僅能夠脅迫ARGs的出現還能夠提高細菌的突變比例[24].越來越多的研究表明，在豬腸道細菌中檢測到四環素類ARG，如tetA、tetB、tetG、tetM等；喹諾酮類ARG，如ermB、ermE、ermF等；喹諾酮類ARG，如qnrA和qnrS等；β-內酰胺類ARG，如blaTEM、blaCTX-M、blaSHV等[25-26].畜禽糞便的堆肥產品對于土壤修復，是將養殖過程中具有耐藥性的病原微生物引入環境的重要途徑之一，也是促進ARGs由養殖環境向土壤轉移的重要途徑.已有較多研究顯示，長期施用糞便導致農田土壤中ARGs的豐度和種類顯著增多(p<0.05)[27-28].具有多重耐藥性的病原菌攜帶的ARGs通過HGT在耐藥菌之間、耐藥菌與土壤微生物之間發生轉移，從而促進環境中ARGs的傳播與擴散.同時，有研究表明，由畜禽糞便而傳播到土壤里的多重耐藥細菌將持久存在于土壤中[29].

因此，本研究從耐藥菌多重耐藥性的角度闡明堆肥過程對磺胺類、四環素類、大環內酯類和喹諾酮類多重耐藥細菌的抗性種類、分布的影響，得出由于不同類別的耐藥細菌對藥物的抗性不同以及對溫度的敏感程度不同，從而影響豬糞好氧堆肥對其削減程度不同，這些研究為完善堆肥產品對環境的風險評價提供理論基礎具有重要意義.

4 結 論

1)豬糞樣品中可培養細菌菌落數為1.05×1010CFU/g，堆肥結束時，CK、P1和P2中可培養細菌菌落數分別為4.88×109，6.25×109和5.31×109CFU/g.

2)豬糞好氧堆肥對CTC、SMZ和ERY耐藥菌能夠有效削減.堆肥結束時，CK、P1和P2堆體對CTC、ERY、SMZ耐藥菌分別削減了0.45log～1.03log、0.46log～0.67log和0.66log～0.76log.由于ENR耐藥菌中嗜熱微生物較多，堆肥結束時CK、P1和P2堆體中的可培養ENR耐藥菌數量分別增加了0.71log、1.43log和0.57log.

3)堆肥可以消減部分多重抗性細菌，但仍有部分多重抗性細菌在堆肥結束后殘存在產品中，這些多重抗性菌是糞肥返田需要關注的環境風險.