HSF1及Akt在三陰性乳腺癌的表達及意義

唐瑋 王翠芳 金丹 王士娜

(沈陽醫學院 1基礎醫學院研究生院，遼寧 沈陽 110034；2附屬中心醫院病理科)

乳腺癌是最常見的危害女性健康的惡性腫瘤之一，死亡率近年來呈上升趨勢〔1〕。三陰性乳腺癌(TNBC)是一種特殊的乳腺癌分型，其雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體(HER)2均表現為陰性，因其惡性程度高、易轉移、易復發等特點，長期以來缺乏特異有效的治療方法，為尋求一種有效的治療方法成為近年來的研究熱點〔2～4〕。熱休克轉錄因子(HSF)1與腫瘤的侵襲轉移及病情發生發展有密切關系。蛋白激酶B(Akt)在細胞存活和凋亡中至關重要，對細胞代謝、細胞增殖、細胞周期等多種生物學行為進行調控。目前有很多關于HSF1與其他癌癥關系的研究〔5，6〕報道，例如肝癌、肺癌、子宮內膜癌等，但HSF1及Akt與三陰性乳腺癌的關系的研究尚少，本研究旨在探討HSF1及Akt在三陰性乳腺癌組織中的表達及其與臨床病理學特征的關系。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取沈陽醫學院附屬中心醫院病理科2010年1月至2018年12月經手術切除證實為TNBC的蠟塊標本64例為研究對象，同時取來自相同患者的癌旁組織標本作為對照組，所有病例經兩位病理科醫師同時確診。患者年齡27～79歲，中位年齡56歲；所有病例術前未接受放化療。

1.2主要試劑 一抗〔HSF1 Rabbit Ab和Akt(pan)(C67E7) Rabbit mAb〕購自Cell Signaling TECHNOLOGY、二抗(酶標羊抗小鼠兔IgG聚合物)購自福州邁新生物技術開發有限公司、粉劑型磷酸鹽緩沖液(PBS)、內源性過氧化物酶購自福州邁新生物技術開發有限公司、二氨基聯苯胺(DAB)染色液(聚合物法)購自福州邁新生物技術開發有限公司、抗原修復液(pH9.0)購自上海基因科技有限公司。

2017年1月，國家能源局印發的《能源技術創新十三五規劃》中指出：“十三五期間重點研究 8 MW～10 MW等級及以上的超大型海上風電機組關鍵技術。降低海上風電場的度電成本，實現5 MW～6 MW等級大型海上風電機組安裝規范化和機組運維智能化”。作為國家戰略性新興產業的重要內容，海上風電已成為風電產業發展的技術制高點，并逐漸成為世界風電產業發展的主要方向。

1.3EnVision兩步法進行免疫組織化學染色 手術腫物切除后使用10%甲醛固定，取材，石蠟包埋，4 μm切片，切好的片80℃烤箱烘烤1 h，石蠟脫水，乙二胺四乙酸(EDTA)(1∶50)高溫高壓修復，自然冷卻40 min，切片放在濕盒上，用濾紙擦干水漬，油筆圈出待測組織區域，之后PBS洗3次、每次3 min，使用內源性過氧化物酶3% H2O2阻斷劑、室溫孵育10 min，PBS洗3次、每次3 min，每張切片滴加50 μl 1∶200濃度的一抗HSF1或Akt、4℃孵育過夜。第二天，室溫放置30 min后，PBS洗3次、每次3 min，每張切片滴加50 μl二抗、室溫孵育15 min，PBS洗3次、每次3 min，每張切片滴加足夠量新鮮配置的DAB顯色液、顯色3～6 min，自來水沖洗，蘇木素復染10 s，自來水沖洗返藍，無水酒精脫水10 min，中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性標本切片作為陽性對照。光鏡下觀察。

2.3 通過探究與拓展，激發“深度學習” 在小組合作中的探究學習能夠讓學生敞開心扉，像專業人員一樣主動發現問題并積極地解決問題，在課堂教學中讓學生沿著科學家探索的足跡，回到那個年代，模擬科學家的思維進行過程探究，不知不覺中學生走向了“深度學習”。

2.2HSF1及Akt在TNBC組織中的表達與臨床病理參數的關系 HSF1陽性表達與腫瘤直徑及淋巴結轉移相關(P<0.05)，且腫瘤直徑越大，陽性率越高，而與年齡及組織學分級無關；Akt陽性表達與腫瘤直徑及組織學分級相關(P<0.05)，且腫瘤直徑越大，陽性率越高；組織學分級越高，陽性率越高，而與年齡及淋巴結轉移無關。見表1。

2.1HSF1及Akt在TNBC組織中的表達 HSF1陽性表達部位主要定位在細胞核，Akt陽性表達部位主要定位在細胞質，見圖1。HSF1在TNBC組織中陽性表達率〔71.88%(46/64)〕明顯高于癌旁對照組〔10.94%(7/64);χ2=48.978，P=0.000〕；Akt在TNBC組織中陽性表達率〔73.44%(47/64)〕明顯高于癌旁對照組〔9.38%(6/64);χ2=51.822，P=0.000〕。

1.5統計學處理 采用SPSS20.0軟件行χ2檢驗及Spearman相關分析。

2 結 果

基于互聯網數據的大學生“中國夢”教育的關鍵因素研究及教育路徑研究..................................................................................................................................王浩業 顏吾佴（58）

圖1 HSF1及Akt在TNBC組織中的表達情況(DAB，×10)

1.4結果判讀 HSF1的陽性表達為細胞核呈棕黃色顆粒，Akt的陽性表達為細胞質呈棕黃色。結果判讀采用雙盲法，由兩位資深病理醫生進行讀片評分。免疫組織化學染色結果判讀標準分兩方面：根據染色強度分為4級：不顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分；根據染色面積分為5級：面積≤ 5% 為0分，面積6%～25% 為1分，面積26% ～ 50% 為2分，面積51% ～ 75% 為3分，面積>75% 為4分。最后將染色強度及染色面積所得分數相乘，0分為陰性(-)，1 ～ 4分為弱陽性(+)，5～9分為中陽性()，>9分為強陽性()〔7〕。

表1 HSF1及Akt表達與臨床病理參數的關系(n)

2.3HSF1及Akt相關性分析 HSF1及Akt共同陽性表達43例，共同陰性表達14例，HSF1陽性表達而Akt陰性表達3例，HSF1陰性表達而Akt陽性表達4例。HSF1與Akt表達呈正相關(r=0.725，P=0.000)。

3 討 論

TNBC是一種異質性腫瘤，異質性是惡性腫瘤的特征之一，腫瘤的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性及預后等各方面存在差異，同一腫瘤中可以存在不同的基因型或亞型的細胞，同一腫瘤在不同的個體身上可以表現出不一樣的治療效果及預后，甚至同一個體身上的腫瘤細胞也存在不同的特性和差異〔8，9〕。十年以來已有相關報道HSF1在癌癥中可能發揮作用，近年來多項研究表明HSF1與卵巢癌、子宮內膜癌、胃癌及乳腺癌等癌癥相關〔5，10，11〕，激活HSF1的幾個關鍵途徑與惡性腫瘤有關，HSF1對癌癥蛋白質組有系統性的影響〔12〕。張喆等〔10〕研究發現HSF1在卵巢高級別漿液性癌中促進侵襲轉移。董麗濤〔11〕研究發現HSF1在子宮內膜癌中異常表達，與淋巴結轉移有關。這與本研究的結果較為一致，說明在TNBC中具有重要的研究價值。Akt在細胞存活和凋亡中至關重要，對細胞代謝、細胞增殖、細胞周期等多種生物學行為進行調控；磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/Akt信號傳導途徑已經成為抗癌治療中較重要的靶標，有研究表明PI3K/Akt與前列腺癌及乳腺癌等癌癥相關〔4，13〕，PI3K/Akt途徑通過其配體刺激受體酪氨酸激酶和其細胞質尾部的磷酸化而被激活。Henderson等〔13〕的研究發現PI3K/Akt在前列腺癌中促進細胞遷移，這與本研究的結果存在一定的相關性。有相關報道在乳腺癌中HSF1-Akt與上皮-間質轉化(EMT)相關〔4〕。Denkert等〔4〕的研究發現HSF1-Akt聯合促進乳腺癌細胞EMT。Carpenter等〔14〕研究發現HSF1-Akt聯合促進乳腺癌的發展與轉移，這與本研究的結果具有一致性。

本研究提示HSF1可能與腫瘤的發生發展及侵襲轉移有關，HSF1的表達是構成性的，HSF1在細胞質內被Hsp90和其他抑制蛋白所控制，HSF1在S326上的核定位和磷酸化是HSF1活性的重要條件，因此核HSF1陽性與侵襲轉移導致的預后不良相關。Akt可能與腫瘤的發生發展及惡性程度有關，PI3K/Akt信號通路對乳腺癌極其重要，大部分乳腺癌有PI3K-AKT活性增強與不良的臨床結果相關，Akt介導的HSF1活化導致EMT，EMT是轉移過程中的早期步驟〔14〕。HSF1與Akt的陽性表達都與腫瘤直徑相關，這一結果為腫瘤的生長方式及轉移形式提供了有力證據。HSF1-Akt在TNBC中呈正相關，具有協同作用，目前關于HSF1-Akt在TNBC中的表達與臨床病理關系的研究尚少，本研究結果可以為進一步研究其機制提供有力的基礎，然而由于本研究采集的病例數還有一定的局限性，接下來將開展細胞水平的研究。