原花青素對DSS誘導的結腸炎小鼠抑郁樣行為的保護作用及機制

徐娜娜 李聰 顧兵

(徐州醫科大學 1基礎醫學院國家級形態學實驗分中心，江蘇 徐州 221004；2附屬醫院ICU；3附屬醫院檢驗科)

潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)被稱為炎癥性腸病(IBD)，是一種自身免疫性疾病，與長期反復發作的胃腸道功能紊亂有關〔1〕。IBD腸道病理表現由中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和肥大細胞腸壁浸潤引起，最終引起黏膜破壞和潰瘍。UC的主要臨床特征包括腹痛、腹瀉、潰瘍、反復發作和復發〔2〕。近年來，臨床研究發現，UC患者常伴有不同程度的精神情感障礙，如焦慮和抑郁等〔3〕，而且這些異常的心理因素會延長病程，誘導疾病復發〔4〕。 Maes〔5〕提出抑郁癥的細胞因子學說，認為抑郁的發生可能與炎癥反應有密切關系。原花青素(PCA)是天然植物多酚，具有高效抗氧化、抗衰老、抗炎、抗輻射、清除自由基等生物活性〔6〕。本研究以5%右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立小鼠UC動物模型，旨在研究PCA對UC模型小鼠抑郁行為的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和試劑 清潔級雄性健康ICR小鼠，8周齡，體重為20 g左右，由徐州醫科大學實驗動物中心提供；PCA為紅褐色結晶性粉末，購自大連美侖生物科技有限公司，純度大于95%；白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α單克隆抗體及二抗購自上海ProteinTech公司，DSS購自美國Sigma公司。

1.2模型制備和實驗分組 24只清潔級雄性小鼠隨機分為對照(NS)組、模型(UC)組和PCA組，每組8只，適應性喂養后，UC組和PCA組給予5% DSS自由飲用水7 d，而NS組給予正常飲用水對照，造模的同時，PCA組給予75 mg/kg PCA灌胃，1次/d，連續7 d，其他各組給予等體積生理鹽水代替，在最后一次灌胃后對各組小鼠進行疾病活動指數(DAI)評分和行為學檢測，處死動物，一部分取大腦海馬組織，Western印跡測定海馬組織IL-6、核因子(NF)-κB蛋白表達量；另一部分心臟灌注后取腦組織，多聚甲醛固定，待脫水透明，石蠟包埋切片。

1.3DAI的評估 每日觀察小鼠的體重、隱血情況及大便性狀，進行DAI評分。將體重下降、大便性狀和隱血情況的評分相加，得出每只小鼠的評分，用以評估疾病的活動情況。評分標準如下：體重減輕(0分，無減輕；1分，減輕1%～5%；2分，減輕6%～10%；3分，減輕11%～20%；4 分，減輕>20%)；大便性狀(0分，正常；1～2分，松散；3～4分，稀便)；血便(0分，正常；1～2分，輕微出血；3～4分，嚴重出血)。

1.4小鼠抑郁樣行為研究和標本采集

1.4.1強迫游泳實驗(FST) 小鼠(n=8)于最后一次灌胃后置于透明玻璃圓柱體中(高：45 cm；直徑：19 cm)，水溫 24℃，水深23 cm，待2 min 適應時間，記錄小鼠連續4 min 不動時間。不動時間是指小鼠在水中放棄掙扎呈漂浮狀態，或只有細微的肢體運動以保持其頭部浮于水面的時間。

1.4.2懸尾實驗(TST) 最后一次灌胃后，用繩子把動物懸吊在離地面40 cm 的高架上，繩子距離尾尖約1 cm。小鼠適應2 min 后，記錄小鼠連續4 min 的不動時間。

1.4.3標本采集 測量完行為學后，每組4只小鼠立即處死，取小鼠腦組織，在冰上分離出大腦海馬組織，存放于凍存管，-80℃ 冰箱保存備用。另外每組4只小鼠，10%水合氯醛按2.5 ml/kg體重腹腔麻醉后，仰臥固定于手術臺，開胸暴露心臟，從左心室插入灌注針頭至升主動脈，止血鉗固定，剪開右心耳，注射器快速推注生理鹽水(室溫)，待血液沖洗干凈后肝臟變白，立即采用輸液裝置滴注多聚甲醛4℃。先快后慢，小鼠四肢肌肉完全僵硬后再維持灌注多聚甲醛。取出結腸組織置多聚甲醛固定液中固定，常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋。

1.5Western印跡測定海馬組織IL-6、NF-κB蛋白表達 將腦組織中加入裂解液，勻漿后，15 000 r/min、4℃離心15 min，所得上清即為胞質蛋白提取液。用4×蛋白處理液配制成等濃度的蛋白樣品，煮沸變性置-20℃冰箱備用。取等量蛋白樣品10%SDS-PAGE分離后，以濕轉移法轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗體孵育后洗膜，顯色后條帶掃描、分析。目的蛋白表達量以Western印跡中各目的蛋白條帶的灰度值與內參β-actin的比值來表示。

1.6海馬組織焦油紫染色觀察CA3區神經元損傷 小鼠麻醉后多聚甲醛心臟灌注，快速取腦后置于多聚甲醛固定24 h。常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片機切片(5 μm)。采用焦油紫染色，37℃下染色15 min，70%酒精分色，二甲苯脫蠟后中性樹脂封片，觀察并計數海馬CA3區1 mm2區域中存活的神經元。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1DAI評分 UC組小鼠從第3天開始出現大便異常，體重下降，第5天大便開始潛血陽性或者便血，說明造模成功。同NS組DAI評分〔(0.5±0.43)分〕相比，UC組〔(3.6±0.54)分〕明顯增加(P<0.05)；而與UC組相比，PCA組評分〔(2.2±0.65)明顯降低(P<0.05)。

2.2抑郁樣行為改變 在強迫游泳實驗中，與NS組〔(67.8±12.96)s〕相比，UC組不動時間〔(179.5±20.45)s〕明顯延長(P<0.05)，而PCA組不動時間〔(87.1±8.37)s〕明顯低于UC組(P<0.05)。而同樣在懸尾實驗中，與NS組〔(50.1±8.14)s〕相比，UC組不動時間〔(127.5±10.82)s〕明顯延長，而PCA組不動時間〔(73.6±9.86)s〕明顯低于UC組(P<0.05)。

2.3對小鼠腦海馬組織中IL-6、NF-κB表達的影響 與NS組比較，UC組小鼠腦海馬組織中IL-6、NF-κB蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與UC組相比，PCA組IL-6、NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 PCA對IL-6、NF-κB/p65蛋白表達的影響

2.4對小鼠海馬CA3區神經元存活數的影響 鏡下可見，NS組〔(157±6.32)個/mm2〕小鼠CA3區神經元排列整齊、緊密，細胞形態飽滿，結構完整，邊緣清晰；與NS組比較，UC組〔(54±4.71)個/mm2〕小鼠CA3區神經元存活數相對較少(P<0.05)，排列紊亂、疏松，細胞形態差，結構不完整，基質疏松及空泡形成；而PCA組神經元存活數提高〔(127±4.97)個/mm2〕，且較UC組有統計學差異(P<0.05)。見圖2。

圖1 PCA對IL-6、NF-κB/p65蛋白表達的影響

圖2 各組海馬CA3區神經元存活情況(焦油紫染色)

3 討 論

UC是一種嚴重的腸道疾病。近年來，國內外研究表明，UC患者常常合并精神情感障礙，如焦慮和抑郁等，臨床研究也證實，被診斷為IBD的患者，患焦慮和抑郁的風險相對更高〔7〕，這嚴重影響患者的身心健康和生活質量，甚至危及生命。懸尾和強迫游泳實驗是評價小鼠抑郁行為的經典實驗，正常小鼠在這兩種實驗中會表現出不斷掙扎的求生欲，而抑郁的小鼠表現出放棄掙扎的狀態，從而使不動時間增加。本實驗結果說明UC小鼠表現出放棄掙扎的抑郁樣行為，而PCA對這種抑郁樣行為有明顯的改善作用。

關于抑郁癥的發病機制目前還不是十分清楚，而Maes〔5〕細胞因子假說的提出，認為抑郁癥與細胞因子的表達密切相關。同時研究也進一步證實了抑郁的患者常伴有免疫激活，表現為促炎性細胞因子分泌增多，抗炎性細胞因子分泌減少〔8〕。因此，細胞因子的表達改變有可能是抑郁癥發病的主要原因之一。而以往研究發現，UC局部強烈的免疫反應可能也與炎癥介質和細胞因子的釋放有關，如IL-6和TNF-α等〔9〕。因此，UC患者常伴抑郁樣的精神情感障礙可能與體內炎性細胞因子分泌的改變有關。

抗氧化劑的使用已經被證明可以減輕急性應激反應引起的焦慮和抑郁〔10〕。PCA是天然植物多酚，在葡萄籽、紫薯、藍莓中含量豐富，屬于雙黃酮衍生物的天然多酚化合物。PCA在體外具有清除自由基及抗脂質過氧化等活性，對氧化損傷有良好的防護作用，國內外對多種植物中的PCA進行了廣泛深入研究，發現其具有抗氧化活性、酶抑制活性、血管保護活性、抗炎活性、抗腫瘤活性等，對自由基及機體抗氧化防御系統有明顯影響。PCA可通過抑制PKC和NF-κB從而減輕高糖誘導的內皮功能障礙〔11〕。此外，還可通過降低IL-6、TNF-α表達，從而降低復發性UC大鼠的炎癥反應和促進受損組織修復，改善結腸氧化應激〔12〕。

此外，CA3區海馬神經元損傷已被證實是抑郁癥的主要病理改變〔13〕。本研究結果發現，PCA干預兩周后，可明顯減輕UC小鼠海馬神經元的損傷，從而對神經元起到很好的保護作用。

綜上所述，PCA可能通過抑制NF-κB的活化，降低IL-6等炎性細胞因子的表達，保護海馬神經元的損傷，從而緩解UC小鼠的抑郁樣行為，但確切的作用機制及作用的時效性還有待于進一步研究。