右美托咪定通過調節神經遞質水平抑制nNOS、PKCγ和PAR-2的表達發揮脊髓鎮痛作用

李鳳丹 張華 王福朝 鄭英霞

(衡水市人民醫院麻醉科，河北 衡水 053000)

內臟痛具有患病率高、病情復雜、缺乏標志物等特點，因此尚缺少治療內臟痛的特異性藥物〔1〕。脊髓鎮痛較大腦鎮痛更具針對性和選擇性。文獻顯示，脊髓鎮痛已在剖宮產術后、脊柱手術后、胃癌等〔2～4〕多種手術和疾病的治療中得到應用，并取得較好的療效，但對內臟痛的鎮痛作用尚缺少文獻報道。因此，積極探索可通過脊髓鎮痛發揮內臟痛鎮痛的新藥及其作用機制，對內臟痛的治療具有重要臨床價值。右美托咪定(DEX)是一種新型高選擇性α2 腎上腺素能受體(α2-AR)激動劑，其可通過激活突觸前、后膜α2-AR，抑制腎上腺素(EP)的釋放，阻礙疼痛信號傳導至中樞，同時還可增加脊髓中一氧化氮(NO)和乙酰膽堿(Ach)的合成與釋放，發揮脊髓水平的抗傷害效應〔5〕。但是，DEX脊髓鎮痛具體的信號轉導通路和分子傳遞過程目前尚不清楚，且其在內臟痛鎮痛中是否也可發揮作用仍缺少報道。研究發現，蛋白激酶(PK)C-NO通路在各種疼痛的產生和維持過程中發揮著重要作用，為疼痛的治療提供了新的思路〔6〕。本研究擬在確定DEX治療內臟痛大鼠具有確切療效的基礎上，考察其對大鼠脊髓中神經遞質水平的影響；同時對PKCγ、一氧化氮合酶(NOS)和蛋白酶激活受體(PAR)-2等PKC-NO痛覺通路相關信號分子水平進行檢測，以期獲得DEX脊髓鎮痛的部分可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選取60只健康SD大鼠，雄性，6～8周齡，體重200～250 g，由河北省實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(冀)2018-0014，動物使用許可證號：SYXK(冀)2018-0027，適應性飼養1 w，期間給予自由飲水和飲食，光照白晝各12 h。

1.1.2主要實驗試劑 鹽酸DEX(規格：2 ml∶200 μg，批準文號：H20090248，產品批號：20180511，生產廠家：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；Ach、去甲腎上腺素(NA)和胍丁胺(AGM)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(規格均為96T，產品批號分別為：E-EL-R0355c、E-EL-0047c、E-EL-R0013c，生產廠家均為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；抗PKCγ、抗nNOS、抗PAR-2抗體(規格均為100 μl，產品批號分別為：59090S、4231S、6976S，生產廠家均為美國Cell Signaling Technology公司)；免疫組化試劑盒(規格為500片，產品批號：BF06099，購自北京博奧龍免疫技術有限公司)。

1.1.3主要儀器和設備 ECG-1106L VET型數字式動物心電圖機購自深圳市凱沃爾電子有限公司；SSW-3型顯微外科手術器械包購自上海醫療器械(集團)有限公司手術器械廠；纖維素濾膜(0.22 μm)、混合纖維素濾膜(0.45 μm)購自德國BM公司；-80℃超低溫冰箱購自青島海爾集團；4℃、-20℃冰箱購自合肥美菱股份有限公司；H1650-W離心機購自湖南湘儀實驗室儀器有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器有限公司；CKX41倒置顯微鏡、IX-71熒光倒置顯微鏡均購自日本Olympus光學工業株式會社；Infinite M1000 Pro全波長酶標儀購自TECAN公司；TANKPE060高純水機購自美國Millipore公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組 60只大鼠，適應性飼養1 w后，稱取體重，根據體重分層隨機分成：對照組(A組，僅鞘內注射生理鹽水10 μl，不予注射甲醛)、模型組(B組，鞘內注射生理鹽水10 μl，予以注射甲醛)和DEX低劑量組(C組，鞘內注射DEX 0.75 μg/kg，予以注射甲醛)、中劑量組(D組，鞘內注射DEX 1.5 μg/kg，予以注射甲醛)和高劑量組(E組，鞘內注射DEX 3.0 μg/kg，予以注射甲醛)〔7〕，每組12只。

1.2.2實驗動物模型的建立 鞘內注射藥物：采用吸入1.5%異氟烷將大鼠進行麻醉，俯臥位固定，使用25 μl微量注射器于脊柱 L5～6間隙的位置(髖結節水平的椎體兩側)垂直進針，試探性回抽腦脊液，當尾巴突然向側向甩動或出現顫動表示穿刺成功，此時按照分組要求緩慢注入藥物。

建立大鼠急性炎性內臟痛模型：完成藥物注射15 min后，維持麻醉，利用37℃生理鹽水清理腸道。在直腸窺器輔助下，于乙狀結腸黏膜(距直腸緣35 mm)處注射100 μl 5%甲醛(注意切勿穿透結腸壁)。完成注射后，停止麻醉，將大鼠放回籠內密切觀察。待大鼠蘇醒后，開始記錄大鼠舔腹部或外陰區域(L)、腹部收縮(A)、伸展身體(B)及肋腹部收縮(F)等行為學反應，并每隔15 min記錄一次疼痛計分〔8〕，至2 h。

1.2.3取材 依照實驗設計方案，在大鼠復蘇2 h后，采用7%濃度水合氯醛對大鼠進行麻醉，快速開胸，進行主動脈插管(遠端插管，近端夾閉)，用37℃生理鹽水沖洗，除去血液，再用4℃ 500 ml 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)進行灌注，固定標本。隨后迅速剪取大鼠脊L2～4節脊髓，置于冰面，利用顯微鏡觀察，切取約兩塊1 mm脊髓背角組織，分別利用液氮(用于ELISA檢測)和4%多聚甲醛〔用于蘇木素-伊紅(HE)染色〕各保存一份備用。

1.2.4HE染色 (1)固定：將取得的大鼠肺組織標本放置在4%濃度的甲醛溶液中充分浸泡30～50 min。 (2)脫水：分別用70%、80%、90%、95%、100%酒精進行梯度脫水。(3)透明：用二甲苯將標本透明2次，以替換標本組織內酒精，此過程需不斷觀察，直至標本透明似琥珀。(4)浸蠟：將透明標本組織放置在溶化好的石蠟里，置于溶蠟箱在65℃下保溫2 h。(5)包埋：觀察石蠟完全浸入到組織中以后進行包埋，待其冷卻凝固以后便成為蠟塊。(6)編號：記錄為標本來源大鼠編號。(7)切片：標本組織蠟塊用切片機在其中部自動橫行切取3張4 μm厚的薄片。(8)貼片：將切片在熱水中燙平，然后再貼在玻片上，置于烤箱58℃恒溫保持4 h。(9)染色：在脫蠟和水洗之后，采用蘇木素進行染色，保持3 min，繼續水洗之后再藍化，保持10 min，使用1%濃度的鹽酸酒精再進行分化，保持20 s，最后伊紅染色，保持5 min。(10)封片：使用70%、80%、90%、95%、100%酒精依次進行脫水，各自保持3 min，使用二甲苯進行透明，保持5 min，最后使用中性樹脂膠完成封片。

1.2.5ELISA 切割組織標本，稱重，利用勻漿器充分勻漿，2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液，備用；按照試劑盒說明書要求制備標準品，在待測樣品孔中的酶標包被板上加40 μl樣品稀釋液，再加10 μl 5倍稀釋的待測樣品?？瞻讓φ湛撞患由鲜鲈噭┖蜆悠罚溆喔鞑讲僮魍郎y樣品孔。封板膜封板37℃溫育，30 min；將濃縮液稀釋30倍后備用；揭掉封板膜，棄去孔內的液體，甩干，在孔內加滿洗滌液，靜置30 s，棄去液體重復5次，甩干；每孔加 50 μl 酶標試劑(除空白對照孔外)；操作步驟同加樣；操作步驟同配液；每孔加 50 μl 顯色劑A，加50 μl顯色劑B，輕輕震蕩，混勻，37℃下避光顯色15 min；每孔加50 μl終止液，終止反應時藍色變為黃色；450 nm波長下依次測量各孔的OD值。

1.2.6Western印跡法 采用Western印跡法對肺組織中κB激酶抑制劑(IKK)、p65的表達進行定量檢測。具體步驟：(1)取出大鼠的肺組織，立即在研磨器內加細胞裂解液放置在冰上進行研磨，持續30 min，將混合液小心吸入到離心管中。(2)將離心管置于低溫高速離心機內，11 000 r/min，4℃離心，持續15 min，棄沉淀，取上清液。(3)將上清液收集起來，BCA法定量檢測蛋白濃度，依照3∶1的比例加入上樣緩沖液，再經過沸水浴持續5 min，進行滅活，在-20℃下儲存，以備后續使用。(4)在110 mV下，用聚丙烯酰胺凝膠電脈(PAGE)進行蛋白質的分離，溴酚藍區帶到達分離膠以后，電壓調至200 mA，持續2 h，溴酚藍區帶進入分離膠末端，并即將泳出分離膠底部，轉至硝酸纖維膜上。(5)按照20∶1的比例在吐溫磷酸鹽緩沖液(PBST)溶液中加脫脂奶粉，室溫條件下封閉1 h，依照一抗的推薦濃度和用量，加入奶粉對一抗進行稀釋。將硝酸纖維膜置于雜交袋，加一抗工作液在袋中，然后封口，4℃條件下，孵育過夜。(6)采用辣根過氧化物酶(HRP)標記好的二抗(抗兔IgG抗體，1∶2 000稀釋)工作液，再封口，37℃條件下，孵育1 h。(7)凝膠成像分析儀掃描并分析結果。繪制標準曲線，并計算濃度，結果用相對灰度值進行表示。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1DEX對大鼠疼痛評分的影響 與A組相比，B組各時間點的疼痛評分均明顯升高(均P<0.05)，且B組最大值出現在造模15 min，隨時間推移B組疼痛評分逐漸下降；C、D、E組大鼠疼痛評分最大值均出現在造模30 min，且較B組分數減少，除C組30 min外，差異均有統計學意義，并呈劑量依賴性(P<0.05)。以上結果提示，鞘內注射DEX對急性炎性內臟痛大鼠具有一定的鎮痛作用，且可推遲疼痛高峰的出現。見表1。

2.2DEX對急性炎性內臟痛大鼠心率的影響 各組大鼠在不同時間點心率之間均無統計學差異(P>0.05)。提示DEX鞘內注射對急性炎性內臟痛大鼠心率無明顯影響。見表1。

表1 DEX對造模不同時間大鼠疼痛評分和心率的影響

2.3DEX對大鼠脊髓中Ach、NA和AGM含量的影響 與A組相比，B、C、D、E組大鼠脊髓中Ach、NA含量均明顯升高(P<0.05)，AGM含量均明顯下降(P<0.05)；而與B組相比，C、D、E組Ach和AGM含量均明顯升高(P<0.05)，NA濃度明顯降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性。見表2。

表2 DEX對大鼠脊髓中Ach、NA、AGM、nNOS、PKCγ和PAR-2含量的影響

2.4DEX對大鼠急性炎性內臟痛脊髓神經毒性的影響 HE染色結果顯示，各組大鼠脊髓神經元細胞染色后，細胞大小均勻，細胞間質光滑、整齊，細胞核和黏液呈藍色或灰藍色，軟骨基質呈深藍色，細胞質呈粉色，嗜酸性顆粒、紅細胞、蛋白性液體等為紅色。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓神經元HE染色(×400)

2.5免疫組化檢測大鼠脊髓組織中PKCγ和nNOS 的表達 如圖2所示，PKCγ陽性細胞多呈圓形或梭形，PKCγ主要分布于細胞胞質內和胞膜上，呈棕黃色，胞內染色較淡，胞膜染色較深。

圖2 脊髓組織中PKCγ表達免疫組化染色(×400)

如圖3所示，nNOS陽性細胞與PKCγ陽性細胞形狀相似，但胞體較小，nNOS主要分布于胞質內，呈棕褐色，染色較深，胞膜和胞核未著色。組間對比可見，與A組相比，B、C、D、E組PKCγ和nNOS陽性細胞明顯增多；而與B組相比，C、D、E組PKCγ和nNOS陽性細胞明顯下降，并呈劑量依賴性。

圖3 脊髓組織中nNOS表達免疫組化染色(×400)

2.6Western印跡檢測大鼠脊髓組織中nNOS、PKCγ和PAR-2蛋白表達 除E組nNOS外，B、C、D、E組大鼠肺組織中nNOS、PKCγ和PAR-2表達較A組明顯增加(P<0.05)，而C、D、E組nNOS、PKCγ和PAR-2表達量較B組明顯下降(P<0.05)，并呈劑量依賴性。由此可推斷，大鼠急性炎性內臟痛可誘導PAR-2通路激活，使nNOS、PKCγ和PAR-2蛋白表達增加，DEX可抑制PAR-2通路激活。見表2、圖4。

圖4 Western印跡檢測脊髓組織nNOS、PKCγ和PAR-2蛋白表達

3 討 論

鞘內注射可將藥物直接注入脊髓組織，使藥物富集于脊髓，同時可減少藥物劑量，因此在疼痛治療中具有一定的優勢。在對鎮痛藥物的研究中，α2腎上腺素能藥物最受重視。Nagasaka等〔9〕發現，給大鼠鞘內注射注入DEX，能顯著減弱疼痛刺激，提示DEX具有一定的神經鎮痛作用，且與可樂定相比，DEX鎮痛療效更優，不良反應較小。也有研究證明，鞘內注射1.5 μg/kg DEX在10 min時可發揮最大鎮痛效應，并持續約6 h，其產生的抗傷害效應約為其他鞘外注射用藥量的5倍，機制主要與激活通過外周和脊髓的α2-AR有關〔10〕。本研究結果顯示，鞘內注射DEX可對急性炎性內臟痛大鼠具有一定的鎮痛作用，且可推遲疼痛高峰的出現，同時結果還顯示鞘內注射DEX對大鼠心率和神經元損傷無明顯影響，但可增加Ach和AGM的表達，降低NA水平。

PKC是蛋白激酶超家族成員的一種，可發揮信號轉導、神經元興奮性調節、細胞增生及神經遞質釋放等多種生物學活性〔11～13〕。當神經發生損傷時，神經細胞會釋放大量P物質(SP)，使胞質內無活性的PKC轉至細胞膜發生活化，活化的PKC又可誘導NOS發生磷酸化，使信號維持時間延長，導致中樞敏化〔14〕。PKCγ是PKC亞型的一種，其主要分布于三叉神經、丘腦核束、皮質脊髓束等神經元細胞〔15〕。有研究表明，PKCγ活化是神經疼痛和炎性疼痛產生的主要機制之一，當小鼠敲除PKCγ基因后，其對刺激性傷害的疼痛反應明顯下降〔16〕。國外研究還發現，利用甲醛在大鼠足底進行注射致痛后，大鼠脊髓背角神經元中的膜上PKCγ明顯增加〔17〕，提示PKCγ參與了機體的軀體痛覺傳入。牛敬忠等〔18〕研究發現，利用甲醛進行直腸內注射致痛后，模型組大鼠神經元PKCγ膜轉位明顯多于對照組；同時，給予PKC激動劑(PMA)刺激后，神經元細胞的膜轉位的程度也顯著增加，說明PKCγ還與炎性內臟疼痛形成密切相關。

早期研究發現，DEX可直接抑制突觸釋放興奮性神經遞質〔SP、降鈣素基因相關肽(CGRP)等〕到脊髓背角，達到抗傷害作用〔19〕。有研究表明，鞘內注射DEX能明顯抑制骨癌大鼠的熱痛覺過敏，同時還可改善大鼠運動功能障礙〔20〕；其機制研究發現，與模型組相比，DEX組大鼠同側脊髓背角中PKCγ水平明顯下降，并呈劑量依賴性〔21〕。也有研究發現，鞘內注射DEX后，坐骨神經損傷大鼠痛覺敏感明顯減輕，其機制與DEX抑制大鼠脊髓背角PKCγ轉膜有關〔22〕。國外研究也表明，鞘內注射DEX可使脊神經結扎大鼠機械性痛敏顯著下降，這與DEX抑制脊髓中NO、nNOS等表達有關〔23〕。為進一步探究DEX發揮鎮痛作用的機制，本研究結果顯示，DEX可明顯降低模型大鼠脊髓 nNOS、PKCγ和PAR-2表達水平。