CHD5基因甲基化與結(jié)直腸癌臨床病理特征和侵襲能力的關(guān)系

唐小鶴 周平 孫美洲 周存金 房玲

(淄博市第一醫(yī)院 1消化內(nèi)一科，山東 淄博 255200；2病理科)

結(jié)直腸癌(CRC)是一種常見于胃腸道的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率僅次于胃癌、原發(fā)性肝癌和食管癌，并據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率、死亡率均位居在全部惡性腫瘤中第5 位，其中新發(fā)病例37.6 萬，死亡病例19.1 萬。城市地區(qū)遠高于農(nóng)村，且結(jié)腸癌的發(fā)病率上升顯著〔1,2〕。由于CRC涉及多種基因的激活或失活，并由多個復(fù)雜階段的積累而形成，其發(fā)生機制目前尚不明確。近年來，抑癌基因(TSG)異常甲基化成為研究者們的焦點，TSG因甲基化而不能正常表達合成抑癌蛋白，細胞抑癌作用被阻斷從而導(dǎo)致單克隆增生，最終形成腫瘤〔3〕。由于TSG異常甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中意義重大，因此為腫瘤發(fā)生機制的研究、早期篩查和診斷提供了重要的靶點。CHD5基因于2003年被發(fā)現(xiàn)，是位于人類lp36染色體上的抑癌基因，通過p19Art/p53細胞通路調(diào)控細胞代謝〔4,5〕。近年來，有報道顯示，CHD5基因甲基化與CRC的臨床表現(xiàn)和發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔6〕。本研究擬分析CHD5基因甲基化與CRC臨床病理特征和侵襲能力的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 篩選2016年1月至2017年6月在淄博市第一醫(yī)院肛腸外科和腫瘤科經(jīng)術(shù)前活檢或術(shù)后病理檢查確診的178例原發(fā)性CRC患者，均經(jīng)過CRC切除術(shù)，且術(shù)前均未經(jīng)過化療和放療等輔助治療，且患者術(shù)后癌旁組織(距離癌組織至少5 cm以上，病理證實無癌細胞浸潤)及正常組織(手術(shù)切緣病理證實無癌細胞浸潤)有完整病例資料和病理鑒定。其中男88例，女90例，年齡41～60歲。所有患者的手術(shù)切除率達92.8%，根治性切除率達88.4%。篩選同期本院內(nèi)鏡科室收集的178例結(jié)直腸腺瘤切除組織。其中男71例，女107例，年齡42～61歲。切除組織立即經(jīng)液氮速凍，超低溫冰箱-80℃冷凍保存。所有研究對象及家屬知情同意并簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準后充分保障研究對象的隱私權(quán)。排除標準：重要臟器(心臟、肝臟、腎臟、肺等)嚴重損傷者；血液生化指標嚴重異常；結(jié)合患者當時身體情況無法接受手術(shù)者；手術(shù)切緣病理證實有腫瘤浸潤者。

1.2試劑與設(shè)備 主要試劑：氯仿、異丙醇、乙醇購自北京鼎國生物技術(shù)責任有限公司；DNA提取試劑盒，亞硫酸鹽修飾試劑盒，購自美國Sigma公司；引物購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；STE試劑、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自北京化學(xué)試劑公司；RNase A、蛋白酶K購自英國Abcam公司。主要設(shè)備：冷凍干燥離心機購自美國Promega公司；高壓蒸汽滅菌器購自德國Thermo Scientific公司；制冰機購自上海斯科茨曼制冰有限公司；紫外可見分光光度計購自德國BRAND公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國熱電公司；超凈工作臺購自北京長城空氣凈化設(shè)備公司；超低溫冰箱購自日本三洋株式會社；電子分析天平購自瑞士METTLER公司；PowerPac電泳儀購自美國Bio-RAD公司；PCR擴增儀購自美國ABI公司。

1.3組織細胞處理 分別稱取100 mg組織：①經(jīng)病理確診的癌組織；②經(jīng)病理證實無腫瘤浸潤的癌旁組織，與癌組織相距≥5 cm；③經(jīng)病理證實無腫瘤浸潤的手術(shù)切除邊緣正常組織；④腺瘤組織。加入900 μl STE和100 μl 10%SDS后置于勻漿器進行勻漿，之后加入6 μl 200 μg/ml RNase A和10 μl 10 mg/ml蛋白酶K，55℃恒溫酶解60 min。

1.4樣本DNA提取及濃度檢測 依據(jù)DNA提取試劑盒操作步驟提取組織DNA。TE溶液對DNA樣品進行20倍稀釋，紫外可見分光光度計在260 mm、280 nm和310 nm處測定OD值，計算OD260/OD280約為1.8即可進行后期實驗，若其大于1.8可能有RNA，小于1.8則可能有蛋白質(zhì)污染，需進一步再純化。DNA樣品于-20℃保存。

1.5甲基特異性PCR(MSP)檢測CHD5基因甲基化 依據(jù)試劑盒說明對提取的DNA進行亞硫酸鹽修飾，以備PCR擴增檢測。甲基化引物：上游：5′-TTAAGGTAGTTTTAAGATTTGTCGTC-3′，下游：5′-TACGAATCTACGATATCTATACCCA-3′，大小197 bp；未甲基化上游：5′-TTTTTAAGGTAGTTTTAAGATTTGTTGTT-3′，下游：5′-TACAAATCTACAATATCTATACCCAA-AA-3′；大小191 bp。擴增程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，57℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。

1.6甲基化判定 利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，判定條件：(1)電泳圖中若只出現(xiàn)未甲基化條帶，計為未甲基化；(2)若出現(xiàn)甲基化條帶，計為甲基化；(3)若既出現(xiàn)甲基化條帶又出現(xiàn)未甲基化條帶，計為甲基化。

1.7RT-PCR檢測CHD5 mRNA表達 提取組織RNA，CHD5上游引物：5′-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC-3′，下游引物：5′-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG-3′；大小108 bp；ATCB上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物：5′-GGTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′；大小156 bp。目的基因CHD5和管家基因ATCB的擴增條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，61℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。以管家基因ATCB作為內(nèi)參，△Ct=△Ct目的-△Ct內(nèi)參，RNA的相對表達量=2-△Ct。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS18.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、LSD法分析。

2 結(jié) 果

2.1各組織中CHD5基因甲基化比例 正常組織甲基化率為12.36%(22/178)；癌旁組織甲基化率為23.60%(42/178)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.24)；腺瘤組織甲基化率為47.75%(85/178)，與正常組織、癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01、0.02)；CRC組織的甲基化率為72.47%(129/178)，與正常組織、癌旁組織和腺瘤組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00、0.00、0.02)。

2.2CHD5基因甲基化與CRC臨床病理學(xué)的關(guān)系 CHD5基因甲基化率與CRC分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期有密切相關(guān)性(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型和浸潤深度無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 CHD5基因甲基化與CRC臨床病理學(xué)的關(guān)系〔n(%)〕

2.3CHD5基因甲基化與CRC腺瘤的臨床病理學(xué)關(guān)系 CHD5基因甲基化率與CRC患者腺瘤病理類型有密切相關(guān)性(P<0.05)；與患者性別、年齡、腺瘤部位、腺瘤直徑和腺瘤數(shù)量無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 CHD5基因甲基化與CRC腺瘤的臨床病理學(xué)的關(guān)系〔n(%)〕

2.4各組織中CHD5 mRNA表達比較 正常組織中CHD5 mRNA表達為(0.246±0.019)，癌旁組織為(0.173±0.014)，腺瘤CHD5 mRNA為(0.159±0.009)，癌組織CHD5 mRNA為(0.015±0.018)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

目前在大多數(shù)國家中，CRC的發(fā)病率逐年呈上升趨勢，尤其在中國，有報道顯示，高脂低纖的不健康飲食方式、肥胖綜合征、家族遺傳和腸道炎癥等是主要的誘病因子〔7～9〕。CRC的致病、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)機制尚不完全明確，主要過程如下：①上皮細胞異常增生；②腺管和腺瘤異常增生；③細胞發(fā)生浸潤形成癌。CRC的早期癥狀并不明顯，容易被忽視，隨著癌細胞的擴增常伴有便秘、便血、腹瀉、腹瀉與便秘不間斷交替、腹痛等癥狀，癌癥晚期常表現(xiàn)為貧血、體重減輕、四肢無力等癥狀〔10〕。目前臨床上主要通過糞便隱血法、血清CEA檢測及影像學(xué)(B超或CT)等來進行CRC早期篩查或術(shù)后復(fù)發(fā)檢測轉(zhuǎn)移病灶〔11〕。但這些方法通常具有敏感性較低，假陰性率高，特異性差，不能發(fā)現(xiàn)較小早期復(fù)發(fā)等缺陷，因此，探尋靈敏性更強的方法對于CRC的預(yù)測、篩查、發(fā)現(xiàn)早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移有極為重要的意義。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，胞嘧啶的第5位碳原子上加上一個甲基基團，從而改變?nèi)旧|(zhì)的空間構(gòu)象，抑制DNA轉(zhuǎn)錄和表達，使之長期處于靜默狀態(tài)〔12〕。若抑癌基因發(fā)生異常甲基化，直接抑制其正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，不能合成抑癌蛋白，最終就可導(dǎo)致腫瘤。最早在視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)的研究中發(fā)現(xiàn)抑癌基因的高度甲基化，通過DNA CpG島的高甲基化修飾抑制抑癌基因的轉(zhuǎn)錄從而引發(fā)腫瘤〔13〕。CHD5是定位于人類1號染色體短臂3區(qū)6帶上的抑癌基因，在甲狀腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、黑色素瘤〔14〕等多種惡性腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)其表達的下調(diào)或靜默，其關(guān)注度也越來越高。近年來有研究發(fā)現(xiàn)CHD5基因甲基化與其表達下調(diào)或缺失有直接關(guān)聯(lián)〔13，15，16〕。Sagimoto等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)CHD5發(fā)生甲基化導(dǎo)致基因抑制是食管癌發(fā)生的重要機制之一。李曉陽等〔18〕也發(fā)現(xiàn)CHD5基因因高度甲基化，在7種胃癌細胞培育株中均出現(xiàn)表達下調(diào)。游焜等〔6〕通過檢測63例胃癌組織及相應(yīng)的癌旁組織發(fā)現(xiàn)CHD5的轉(zhuǎn)錄和翻譯均低于正常組織。這些研究均證實CHD5基因的甲基化與胃癌的臨床病理程度和侵襲能力關(guān)系密切〔19〕。

賴曉波等〔20〕發(fā)現(xiàn)CHD5 mRNA的表達在癌旁組織和遠端正常組織中高于癌組織，推斷出CHD5 mRNA的表達與CRC的侵襲程度和發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果說明CHD5甲基化致使CHD5 mRNA表達下降，癌細胞侵襲能力增強。馬棟等〔21〕結(jié)合相應(yīng)的病理特征，發(fā)現(xiàn)不同國家CRC患者中，非裔美國人CHD5基因甲基化水平高于伊朗人，差異具有顯著性，可間接推斷出CHD5基因甲基化與地域、飲食習慣等有關(guān)。本研究結(jié)果還表明CHD5基因甲基化作用于CRC的整個發(fā)展過程，但其發(fā)病因素尚不明確。根據(jù)研究提示，約80%的CRC系由結(jié)直腸腺瘤演變而來，其演變過程需要7～10年〔22～24〕，而管狀-絨毛狀腺瘤的惡變率高達 19.51%～33.60%〔25～27〕，本研究表明CHD5基因甲基化率與CRC患者腺瘤病理類型有密切相關(guān)性，其中絨毛狀腺瘤甲基化率最高，由此可推斷出絨毛狀腺瘤病變惡化的概率更大，CHD5基因甲基化與CRC的早期發(fā)生相關(guān)聯(lián)〔22〕。綜上，抑癌基因CHD5的DNA甲基化檢測可應(yīng)用于CRC的預(yù)測、篩查、病情監(jiān)測及預(yù)后判斷，對患者手術(shù)及術(shù)后治療方案的制訂和預(yù)后具有重要意義。