神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠前額葉皮質5-羥色胺2A和γ-氨基丁酸b受體表達的影響

李益歡 錢春生 張斌 何云文 陳傳新

(江蘇大學 1醫學院，江蘇 鎮江 212013；2附屬金壇醫院神經外科)

腦外傷導致的昏迷仍是世界范圍內的難題，對患者本人和家庭的影響巨大〔1〕。近年來，部分學者認為迷走神經電刺激具有一定的促醒潛能，可通過刺激迷走神經對大腦皮層重要區域進行調控，但具體機制尚未闡明〔2〕。5-羥色胺2A受體(5-HT2AR)和γ-氨基丁酸b受體(GABAbR)是腦內與睡眠覺醒密切相關的物質〔3〕。為探究迷走神經電刺激對兩者表達的影響，本研究對腦外傷昏迷大鼠進行相關實驗。

1 資料和方法

1.1實驗動物及分組 108只雄性成年SD大鼠(由華西醫學院實驗動物中心提供)，清潔級，體質量250～300 g，自然光照下常規飼養，室溫保持在23℃左右。根據隨機數字表法將其分為刺激組、假刺激組和空白組各36只。實驗大鼠均健康，刺激組平均體重(232.7±7.6)g，假刺激組平均體重(233.5±7.7)g，空白組平均體重(233.0±7.5)g，3組大鼠體重無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2實驗設備及試劑 (1)MNT冷凍切片機(德國SLEE公司)；(2)ES-420型電刺激儀(日本伊藤超短波株式會社)；(3)Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機(艾本德中國有限公司)；(4)MY2300全自動免疫組織化學染色儀(澳大利亞郝思林公司)；(5)兔抗GABAbR抗體(ab75239)和兔抗5-HT2AR抗體(BA47258)均購自武漢博士德有限公司；(6)10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1腦外傷昏迷大鼠模型制備 通過自由落體撞擊法制備腦外傷昏迷大鼠模型。具體步驟：將刺激組和假刺激組大鼠放在標本缸中，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.5 ml/100 g)。麻醉后頭頂備皮消毒，逐層切開至暴露頂骨。在人字縫與顱頂冠狀縫交點處固定一圓形鐵板。大鼠恢復后爪疼痛刺激反射時，采用重400 g的金屬撞擊錘由40 cm高度自由下落撞擊鐵板。撞擊后30 min評估大鼠意識狀態，以翻正反射消失和(或)后爪疼痛反射消失并持續30 min定義為昏迷狀態，建模成功〔4〕。

1.3.2實驗過程及切片制備 將建模成功的刺激組大鼠仰臥位固定，去除頸毛，在胸骨與喉部間沿正中線取3 cm切口，將胸骨甲狀肌和胸骨舌骨肌分離、固定。找到頸動脈鞘后將頸部肌肉和皮膚固定，用止血鉗將左側迷走神經鈍性分離3 cm。將電極連接至左側迷走神經進行電刺激(電流1.5 mA，脈寬0.6 ms，頻率25 Hz)，單次刺激時間30 s，兩次間隔時間5 min，總刺激時間5 min。電刺激結束后去除電極，縫合切口，消毒后放回籠中。假刺激組手術操作同刺激組，但無電流輸出。空白組實驗全程無任何處理。3組于干預后12 h和24 h時分別以灌注過量10%水合氯醛的方式處死18只大鼠。處死后取前額葉皮質，先后經固定、脫水等處理后制得5 μm切片。

1.3.3免疫組織化學測定 將制得的切片首先脫蠟，然后浸泡于75%枸櫞酸鈉溶液中，時間20 min。后經由磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗(0.02 mol/L)，時間20 min。室溫條件下，將沖洗后的切片先后經20%過氧化氫浸泡和蒸餾水沖洗，分別為15 min。滴加兔抗GABAbR抗體(1∶300)和兔抗5-HT2AR抗體(1∶300)，靜置12 h(環境溫度2℃)，染色，于配套顯色盒下顯色。

1.4觀察指標 (1)定義翻正反射出現為覺醒，干預后12 h記錄各組覺醒大鼠數量〔5〕；(2)顯微鏡下觀察前額葉皮質中GABAbR和5-HT2AR陽性細胞的數量，以染色呈棕色或棕褐色為陽性細胞標準，計算免疫組化(IHC)評分。評分標準：A表示陽性細胞數量級，<1%計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，81%～100%計4分；陽性細胞染色程度分級用B表示，分別計0～3分，依次對應陰性、弱陽性、陽性和強陽性。IHC=A×B〔6〕。

1.5統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、獨立樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.13組大鼠意識狀態比較 刺激組和假刺激組大鼠均建模成功。干預后12 h，3組覺醒大鼠比例由高到低依次為空白組〔36只(100.0%)〕、刺激組〔27只(75.0%)〕和假刺激組〔13只(36.1%)〕，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.23組不同時間點前額葉皮質5-HT2AR IHC評分 干預后12、24 h時3組前額葉皮質5-HT2AR IHC評分由高到低依次為空白組、刺激組和假刺激組，兩兩比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。各組不同時間點前額葉皮質5-HT2AR IHC評分差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1，圖1。

表1 3組不同時間點前額葉皮質5-HT2AR IHC評分比較

空白組

刺激組

假刺激組

2.33組不同時間點前額葉皮質GABAbR IHC評分比較 干預后12 h和24 h時3組前額葉皮質GABAbR IHC評分由高到低依次為假刺激組、空白組和刺激組(均P<0.05)。各組不同時間點前額葉皮質GABAbR IHC評分差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2，圖2。

表2 3組不同時間點前額葉皮質GABAbR IHC評分比較

空白組

刺激組

假刺激組

3 討 論

昏迷是腦外傷后最嚴重的并發癥之一，約15%腦外傷昏迷患者出院時仍處于昏迷狀態，不僅大大降低了整個家庭的生活質量，同時加重了經濟負擔，對于此類病人的促覺醒治療一直是臨床上不易攻克的難關〔7〕。神經刺激法治療腦外傷昏迷由來已久，常見方法包括經顱磁刺激、正中神經電刺激、經顱直流電刺激等，效果不甚理想，同時具有較大的副作用〔8〕。迷走神經屬于混合型神經纖維，其在大腦皮質內廣泛性投射的解剖特點一直被認為是治療各種神經系統疾病的結構基礎〔9〕。動物實驗證實，電刺激大鼠的迷走神經具有改善認知和運動功能的作用，其機制與抗水腫、保護血腦屏障和神經元等途徑有關〔10〕。臨床上迷走神經電刺激多用于治療偏頭痛、阿爾茨海默病和帕金森病等，效果顯著〔11〕。近年來，有報道稱迷走神經電刺激可縮短腦外傷后癲癇患者白天快速動眼睡眠周期和嗜睡時間，并延長覺醒時間〔12〕。

本研究通過動物實驗分析迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠的促覺醒作用和機制，具有較高的臨床意義。本研究干預后12 h，刺激組覺醒比例高于假刺激組，與杜青等〔13〕研究的結果一致，證實迷走神經電刺激具有促昏迷大鼠覺醒的作用。GABAbR為抑制性神經遞質的受體，廣泛分布在哺乳動物的中樞神經系統中，參與了負性情緒、癲癇、睡眠等生理或病理過程；5-HT2AR是5-HTR亞型中分布最為廣泛的一類受體，特別是在前額葉皮層中大量分布，研究認為其與覺醒的調節密切相關〔14,15〕。本研究說明迷走神經電刺激的促覺醒作用可能通過上調5-HT2AR表達，下調GABAbR表達有關，假刺激組GABAbR和5-HT2AR的表達高于空白組可能與腦外傷后的應激作用有關。

本次研究的主要不足有以下3點：(1)實驗樣本量過小，且僅對前額葉皮質中GABAbR和5-HT2AR的表達進行了檢測，其他促覺醒腦區是否有所改變尚需進一步探究；(2)測定物質表達的時間點較少，因此干預后不同時間GABAbR和5-HT2AR變化的結果存在一定局限性，接下來的實驗匯總應增加時間點使結果更客觀、可靠；(3)迷走神經電刺激在臨床上仍屬于有創操作，用于臨床存在一定局限性，如何通過無創方法達到類似效果有待進一步研究。