張良姜同源四倍體誘導

姚鵬強 袁軼 程世平

摘要：為解決張良姜繁殖系數低、容易感染病菌的問題，進一步加快張良姜育種進程，以河南省魯山縣張良鎮種姜為材料，首先建立張良姜莖尖離體培養再生體系，進一步利用秋水仙堿對其體細胞染色體進行誘導加倍。結果表明，張良姜莖尖不定芽誘導的最適培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 01 mg/L，不定芽誘導率達83.33%。不定芽生根的最適培養基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L，生根率可達86.67%。張良姜同源四倍體誘導最佳處理組合為100 mg/L秋水仙堿浸泡莖尖72 h再接種培養，四倍體最高誘導率為8.89%。對照組張良姜為二倍體（2n=2x=22），誘導獲得的四倍體張良姜染色體為2n=4x=44。共獲得7個四倍體植株，繼代培養3次后倍性保持穩定，可為張良姜良種選育提供良好的原始材料。

關鍵詞：張良姜;離體培養;染色體加倍;同源四倍體

中圖分類號：S632.503 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2021）02-0104-04

收稿日期：2020-05-19

基金項目：平頂山學院高層次人才科研啟動項目（編號：BXY-BSQD-2018031、PXY-BSQD2016009）;河南省科技攻關計劃（編號：182102110132、172102110111、）。

作者簡介：姚鵬強（1986—），男，云南曲靖人，博士，講師，主要研究方向為植物多倍體遺傳育種。E-mail：yaopengqiang1988@163.com。

張良姜為姜科姜屬多年生草本植物[1-4]，原產于河南省魯山縣張良鎮，距今已有2 200多年的種植歷史。2010年5月，張良姜被授予國家農產品地理標志登記保護，是全國首個獲得農產品地理標志登記保護的生姜產品，享有姜中之王的美譽[5]，其色澤金黃、久煮不爛、辛辣芳香[6]，是集調味品、食品加工原料、藥用于一體的多用途經濟作物[7-9]。

長期以來，張良姜主要利用地下塊根進行無性繁殖，伴隨一些病毒病菌經常導致產量和品質的下降，并且長期無性繁殖會造成種性退化[10-11]。植物組織培養脫毒技術是提高姜產量和品質最為有效的方法之一[12-14]。因此，有必要通過組織培養技術對現有優良張良姜進行脫毒和復壯，提高品種自身抗逆性和增產潛力。

目前，張良姜育種還處于起步階段，其雌雄花敗育，常規雜交育種難以發揮作用。然而，在組織培養的基礎上，利用體細胞染色體加倍技術來獲取多倍體具有巨大的育種價值。許多研究表明，多倍體植物在育種方面具有生活能力強以及抗病蟲害等特點[15-18]。本研究以張良姜幼嫩芽為外植體，首先建立其離體培養再生體系，之后通過秋水仙堿誘導其體細胞染色體加倍，獲得張良姜同源四倍體。此研究旨在推動張良姜產業發展，以期培育張良姜新品種。

1材料與方法

1.1試驗材料

選擇健壯、無病的張良種姜為材料。試驗在河南省平頂山學院化學與環境工程學院低山丘陵重點實驗室，于2017年4月至2019年5月份進行。

1.2初代培養基配制

初代培養基配制以MS為基礎培養基，分別添加不同濃度的NAA（萘乙酸）、6-BA（6-芐氨基嘌呤），具體激素組合見表1，處理編號依次記為M1～M4。所配制的4個培養基配方處理中蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.75%，pH值范圍為5.6～5.8。每個培養基配制30瓶。

1.3外植體消毒與接種

對張良姜種姜進行催芽處理，將未發芽的姜塊放入鐵托盤，噴灑適量水，蓋上塑料膜，25 ℃下培養催芽。待芽長出1 cm左右，用手術刀切取幼芽，首先用70%乙醇處理1 min，無菌水沖洗2～3次，再用0.1%氯化汞消毒12～15 min，無菌水沖洗3次，去除幼芽外層2～3層幼葉，將莖尖接種于培養基，每瓶接種1個外植體。放入培養室中培養，培養溫度為（25±1） ℃，光照度為2 000～3 000 lx，培養 30 d 后觀察統計愈傷組織及不定芽數量。

1.4生根培養

選取2～3 cm生長狀態相同的單個叢生芽，分別接種于添加不同濃度6-BA（0.5、1.0 mg/L）或NAA（0.5、1.0 mg/L）以及不添加激素的9種生根培養基（K0～K8）中進行生根培養，20 d后統計生根率。每個培養基接種1個芽，每種培養基接種15個叢生芽，重復3次。

1.5秋水仙堿誘導張良姜體細胞染色體加倍

分別配制濃度為50、100、150、200 mg/L的秋水仙堿溶液，用無菌過濾器過濾。選取健壯的組培苗，將其頂芽及帶有側芽的莖段切下，分別放入不同濃度的秋水仙堿溶液中。黑暗環境下，在振蕩培養箱中分別培養24、48、72、96 h。之后用無菌水沖洗材料4～5次，用無菌濾紙將材料表面水分吸干，將材料接種到繼代培養基上培養。每個處理組合重復3次，每個重復分5瓶，每瓶接種3個材料。20 d 后統計外植體存活率。

1.6倍性鑒定

取第3次繼代培養的幼苗嫩葉，利用流式細胞儀（sysmex partec GmbH）進行檢測，取幼嫩葉片約 1 cm2 大小放入一次性塑料皿中，加入200 μL細胞裂解液[希森美康生物科技（無錫）有限公司]，然后用鋒利的刀片迅速將其切碎，30 μm孔徑濾網過濾，加入800 μL DAPI染色液[希森美康生物科技（無錫）有限公司]，以二倍體材料為內參進行倍性檢測。

之后，利用流式細胞儀檢測的植株進行染色體壓片計數進一步確定倍性水平。以張良姜組培苗幼嫩根尖為材料。飽和對二氯苯中預處理3 h，經蒸餾水沖洗后，置于卡諾固定液（V無水乙醇 ∶V冰醋酸= 3 ∶1），4 ℃固定24 h。之后，將材料轉移到1 mol/L鹽酸溶液中酸解10～15 min，蒸餾水沖洗并浸泡 10 min。取少量材料置于載玻片上，滴加卡寶品紅染色液染色5 min，蓋上蓋玻片，壓片，置于顯微鏡下觀察計數。

2結果與分析

2.1初代培養基的篩選

不同初代培養基誘導張良姜不定芽效果如表2所示，在NAA濃度相同的情況下，添加不同濃度的6-BA進行不定芽的誘導，其中，以M3組合最好，不定芽誘導率達83.3%，即張良姜莖尖再生較適合培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

2.2不同培養基對張良姜生根的影響

由表3可以看出，在生根培養基中，生根效果最差的培養基為K0，即不添加植物激素的MS/2培養基，在添加NAA或IBA之后，各個處理的生根率都有不同程度的提高。總體來看，NAA和IBA 2種激素在誘導生根效果方面存在一定差異。在相同濃度下，添加NAA比 IBA的生根效果更佳。其中，NAA的濃度為0.5 mg/L最適合叢生芽生根，生根率可達86.67%。因此，MS/2+NAA 0.5 mg/L為誘導張良姜叢生芽生根的最適培養基。

2.3張良姜同源四倍體誘導

對誘導獲得的張良姜植株進行倍性鑒定。四倍體張良姜的峰值在橫坐標上是內參二倍體的2倍（圖1-a）。染色體壓片計數結果表明，未經處理的二倍體張良姜染色體數為2n=2=22（圖1-b），誘導獲得的四倍體染色體數為2n=4x=44（圖1-c）。

不同濃度的秋水仙堿以及不同的處理時間對張良姜外植體存活率、不定芽的誘導率以及四倍體誘導率的影響結果如表4所示。結果表明，外植體的存活數隨著秋水仙堿濃度的增加以及處理時間的增加而降低，秋水仙堿濃度在50～200 mg/L范圍，持續處理時間在96 h內，均有不定芽的產生。當秋水仙堿濃度為100 mg/L、處理72 h時，誘導獲得張良姜同源四倍體4個，是本試驗篩選的最優處理組合。

3討論與結論

利用組培技術，可以實現張良姜脫毒種苗的快速繁殖。一些研究表明，NAA和6-BA的組合能夠更好地促進生姜幼芽的分化和增殖[19-20]。總的來說，培養基中植物激素的成分和濃度對張良姜快繁有顯著的影響。通過試驗可以發現，在NAA濃度相同的情況下，當添加的6-BA濃度由0.5 mg/L逐漸增加到2.0 mg/L時，不定芽的分化率增高，但當6-BA濃度增加到3.0 mg/L時，不定芽的分化率開始下降，出現了一定的畸形芽。齊蘭等在研究海南小黃姜脫毒快繁技術時也發現，當6-BA的濃度高于3 mg/L時，可能會導致畸形苗及弱苗的增多[21]。由此認為，當6-BA的濃度為2.0 mg/L時，張良姜不定芽的誘導效果較好。

張良姜不定芽生根誘導，其最適宜培養基為 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L，本試驗中添加外源激素NAA和IBA均可誘導張良姜不定芽生根，其中添加NAA的效果好于添加IBA，與黃姜的根誘導情況[19]類似。在生姜的研究中，同時添加6-BA和NAA可以實現生姜增殖與生根誘導同步進行，其中NAA對生根數和平均根長有較大影響，6-BA對生姜生根數和長度無顯著影響[11]。小黃姜的脫毒組培技術研究也表明，同時添加6-BA和NAA可使生根壯苗和繼代增殖同步完成[21-22]。而在本研究中，在所使用的初代培養基培養下，有部分不定芽有根的分化，生根率遠低于加入NAA的生根培養基。因此，對于張良姜而言，將不定芽的誘導和生根誘導分別進行效果更佳。

秋水仙堿是人工誘導植物多倍體最為常用的化學試劑之一，成功的關鍵在于秋水仙堿的處理濃度及處理時間[23-25]。在本研究中，以秋水仙堿濃度100 mg/L處理72 h效果最好，其次是150 mg/L處理72 h，較低的秋水仙堿濃度如50 mg/L并未獲得多倍體。而郭啟高等對生姜進行多倍體誘導結果表明，在培養基中加入30 mg/L秋水仙堿處理5 d可使生姜的誘變率達到65.0%[26]。說明使用較低濃度秋水仙堿處理時須延長處理時間方能發揮作用。另外，有效的藥劑濃度與誘導處理方式也有很大關系。利用秋水仙堿對姜芽進行浸泡后再接種所使用的濃度通常比直接在培養基中加入進行接種的濃度要高許多[26-27]，如曾楊等對脫毒生姜進行四倍體誘導研究表明，0.2%秋水仙堿浸泡生姜芽12 h的誘導率最高[28]。通過對張良姜頂芽及帶有側芽的莖段進行秋水仙堿處理誘導獲得同源四倍體植株，可為張良姜良種的選育提供原始材料，為后續篩選優良品系奠定基礎。

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