日本三角渦蟲體內Djcullin1基因和Djtinp1基因的相互作用研究

張芬熙，董自梅，陳廣文*，劉德增

(1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉453007； 2.新鄉醫學院基礎醫學院，河南新鄉453003)

渦蟲是動物界最早出現的兩側對稱、具有三胚層的類群，在動物系統演化過程中占有重要地位，日本三角渦蟲Dugesiajaponica是渦蟲綱Turbellaria的代表動物(張合彩等，2009)。渦蟲由于具有很強的再生能力，被廣泛地用于再生生物學研究。Cullin1是泛素連接酶復合體的重要組成分子，對復合體的形成起關鍵調節作用(Chenetal.，2015)。Cullin1可通過調控細胞周期進程從G1期到G0期轉變，進而調控細胞的增殖與凋亡(Johnstonetal.，2005)。Strand等(2018)發現Smedcullin1基因在地中海渦蟲Schmidteamediterranea中陽性表達，敲減Smedcullin1基因可抑制渦蟲體內細胞分化以及神經系統再生，并導致地中海渦蟲再生缺陷。

泛素蛋白酶體途徑對細胞內錯誤折疊蛋白的降解具有重要的調節作用，且參與胞內關鍵生理進程，Cullin1參與構成Skp1-Cullin1-F-box(CF)復合體，是泛素E3連接酶的重要組成部分，SCF復合體可以與攜帶泛素分子的E2酶相互識別，參與泛素化過程中底物的識別并招募(Skaaretal.，2013；楊楊楊等，2015)。Cullin1是經典TGF-β信號通路中Smad2/3的抑制因子，有可能通過TGF-β信號通路在渦蟲再生過程中發揮一定調控作用。

Chen和Xu(2017)利用二維電泳鑒定三角渦蟲尾部再生過程中蛋白質組學的變化，發現TGF-β及其下游信號Smad4在渦蟲尾部再生過程中明顯升高，提示TGF-β信號通路可能在渦蟲尾部再生過程中發揮重要作用。Ermakov等(2014)利用藥物抑制劑干預TGF-β和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MEK)可明顯抑制地中海渦蟲頭部再生以及干細胞增殖，提示TGF-β信號通路可能參與渦蟲頭部的再生。

TGF-β誘導核蛋白1基因(TGF-β-inducible nuclear protein 1，tinp1)是近期在研究毛細胞白血病的抑癌基因過程中被發現的，因此又被命名為毛細胞白血病蛋白1基因(hairy cell leukemia protein 1，hclp1)。tinp1基因是酵母nsa2基因的同源物，Nsa2蛋白被證明是核糖體生物發生的限制因子及細胞增殖必需因子，亦被認為是從酵母到人類最保守的蛋白之一(Lebretonetal.，2006；Zhangetal.，2010)。相關研究顯示，在白血病病人體內或人白血病細胞中，TGF-β的活化可誘導Tinp1表達上調(Evenetal.，2019)。此外，Shahni等(2013)的研究還顯示，給予體外培養的系膜細胞外源性TGF-β1不僅可以增強Tinp1 mRNA/protein在細胞內的表達水平，還可影響其在細胞內的分布與定位，誘導細胞漿內的Tinp1蛋白迅速向細胞核內遷移。Sun等(2019)研究顯示，敲減smad4基因可抑制TGF-β信號通路，進而降低渦蟲體內tinp1基因的表達，抑制渦蟲中樞神經系統的再生。上述研究進展提示，TGF-β信號通路可以通過調控tinp1參與渦蟲再生。

日本三角渦蟲中cullin1基因(Djcullin1)和tinp1基因(Djtinp1)二者之間是否存在關系，是否可以通過TGF-β信號通路發生作用，當前仍不清楚。因此，本研究通過敲減日本三角渦蟲體內Djcullin1基因，研究TGF-β信號通路smad2/3(Djsmad2/3)、smad4(Djsmad4)和Djtinp1等基因及蛋白在渦蟲體內的表達，然后又敲減Djtinp1基因，研究Djcullin1基因及蛋白在渦蟲體內的表達，從而推斷Djcullin1和Djtinp1基因在渦蟲中的相互作用關系。

1 材料與方法

1.1 日本三角渦蟲的來源與飼養

日本三角渦蟲采自河南省鶴壁市魚泉泉水。采集后利用魚泉泉水于20 ℃恒溫培養箱中避光養殖，第2天換掉一半魚泉泉水，加入一半曝氣的自來水，第3天全部用曝氣的自來水，以后每日于曝氣自來水中培養，每7 d左右喂食新鮮牛肝勻漿 1次，喂食2 h后換曝氣自來水。

1.2 RNAi干擾渦蟲體內Djcullin1和Djtinp1基因

將Djcullin1或Djtinp1基因的目的片段通過雙酶切法與L4440載體相連接，轉入大腸桿菌HT115感受態細胞，通過在培養基中添加IPTG誘導目的基因雙鏈RNA的合成后，將菌種離心沉淀后混合在1 mL牛肝勻漿中，通過喂食達到干擾目的，對照組渦蟲喂食未轉染目的基因的HT115菌液。每隔1 d干擾喂食1次，共喂食6次，每天更換曝氣自來水，實驗處理前饑餓渦蟲1周。

1.3 總RNA的提取

取干擾后饑餓1周的渦蟲，用滅菌水和DEPC水依次沖洗渦蟲3遍，轉入無RNA酶的EP管中，加入1 mL Trizol，-80 ℃冷凍1 h，而后輕柔吹打，待渦蟲完全溶解后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。取上清850 μL，加入200 μL氯仿，混勻后室溫靜置 5 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。離心后，取上層無色水相(約300 μL)，與等量異丙醇混勻，室溫靜置10 min，而后4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，利用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀RNA 2次。離心后，室溫干燥5 min，加入30 μL DEPC水溶解RNA沉淀。

1.4 實時熒光定量PCR(qPCR)

利用DNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒說明書進行cDNA合成，Nanodrop檢測cDNA濃度，具體步驟參見程方方(2016)。利用ABI PRISM 7500實時熒光定量PCR儀器(Applied Biosystems)、SYBR Green qPCR Master Mix (TaKaRa)和1 μg cDNA進行PCR，反應體系50 μL。采用2-ΔΔCt法分別計算Djcullin1和Djtinp1mRNA的相對表達量，每個實驗重復3次，每次6只渦蟲(表1)。引物見表1。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 整體原位雜交實驗

按Cheng等(2015)的方法對渦蟲進行整體原位雜交染色，分別檢測Djcullin1和Djtinp1的表達。每組選取6條渦蟲，2%鹽酸處死后，4%多聚甲醛固定，梯度甲醇脫水，H2O2漂白過夜。第2天梯度甲醇復水，蛋白酶K室溫孵育10 min，然后4%多聚甲醛固定20 min。用含探針的雜交液(1∶400)處理渦蟲16 h。MABT洗滌2次后，馬血清封閉2 h。加入馬血清稀釋的Antibody solution(1∶2 000)4 ℃過夜。MABT洗滌后，NBT/BCTP顯色。

1.6 Western Blotting

干擾喂食渦蟲結束后再饑餓7 d，將渦蟲組織研磨碎，并提取蛋白。采用蛋白提取試劑盒，其中含有20 mL 5×裂解緩沖液、0.5 mL蛋白酶抑制劑、0.5 mL磷酸酶抑制劑和0.5 mL苯甲基磺酰氟[寶生物工程(大連)有限公司]。用標準的Bradford蛋白測定法測定蛋白濃度。后續試驗參考Zhang等(2019)進行Western Blotting分析。電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上。在TBS-T中，用5%BSA或5%脫脂奶(生產商說明)將膜封住，然后4 ℃環境樣本與Smad2/3(CST，8685s)、Smad4(BIOSS，bs-23966r)、Cullin1(Servicebio，PA1557)；Tinp1(Signalway，29601)及β-actin(Servicebio，GB12001)抗體(1∶100)孵育過夜后在室溫下用酶標二抗(1∶3 000)對印跡孵育1 h。增強化學發光檢測免疫反應條帶。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 Djcullin1和Djtinp1基因干擾效果

喂食未轉染目的基因HT115菌液的渦蟲為對照組。喂食含Djcullin1基因或Djtinp1基因的目的片段的TH115菌液的渦蟲為干擾組。在基因干擾結束后，利用qPCR及整體原位雜交技術檢測Djcullin1基因干擾組和對照組渦蟲體內Djcullin1基因的表達，檢測Djtinp1基因干擾組和對照組渦蟲體內Djtinp1基因的表達，驗證2個基因的干擾效果。與對照組比較，Djcullin1基因干擾組渦蟲體內Djcullin1基因的mRNA表達明顯降低(圖1：A，C)，Djtinp1基因干擾組渦蟲體內Djtinp1基因的mRNA表達也顯著降低(圖1：B，D)，這說明2個基因敲減成功。

2.2 敲減Djcullin1基因后渦蟲體內Djsmad2/3、Djsmad4及Djtinp1基因的mRNA表達

qPCR發現，Djcullin1基因敲減后TGF-β信號通路相關分子Djsmad2/3、Djsmad4和Djtinp1基因的mRNA表達量明顯增高(圖2)。

2.3 敲減Djcullin1基因后整體原位雜交檢測渦蟲TGF-β通路相關基因的表達

結果顯示，Djcullin1基因干擾后,Djsmad2/3、Djsmad4和Djtinp1基因的表達與qPCR結果一致，表達明顯增高(圖3)。

2.4 敲減Djcullin1基因后渦蟲體內Smad2/3、Smad4及Tinp1蛋白的表達

Western Blotting結果顯示，Djcullin1基因干擾后，渦蟲體內與TGF-β通路相關的Smad2/3、Smad4和Tinp1蛋白的表達與熒光定量結果及原位雜交一樣，均明顯增高(圖4)。

2.5 敲減Djtinp1基因后qPCR檢測渦蟲Djcullin1基因的表達

qPCR結果顯示，與對照組比較，Djtinp1基因干擾組渦蟲體內Djcullin1基因的mRNA表達量明顯升高(圖5)。

2.6 敲減Djtinp1基因后原位雜交檢測渦蟲Djcullin1基因的表達

原位雜交檢測結果顯示，與對照組比較，Djtinp1基因干擾組渦蟲體內Djcullin1基因的mRNA表達量明顯升高(圖6)。

2.7 敲減Djtinp1基因后Western Blotting檢測渦蟲Cullin1蛋白的表達

Western Blotting結果顯示，Djtinp1基因干擾后，Cullin1蛋白的表達明顯增高(圖7)。

3 討論

日本三角渦蟲由于其強大的再生能力，已被廣泛地應用于再生生物學研究。Cullin1為細胞周期重要調控分子，與細胞增殖、凋亡和分化均有密切關系(Johnstonetal.，2005；Chenetal.，2015)。Tinp1為TGF-β信號通路的下游信號分子，也與細胞增殖和凋亡有一定的關系(Chen & Xu，2017)。cullin1基因和tinp1基因均在渦蟲體內呈陽性表達，且參與渦蟲多種組織和器官的再生(Strandetal.，2018；Sunetal.，2019)。但渦蟲體內兩者之間的關系仍不清楚。

Cullin1蛋白是Cullins家族中最早發現的成員，也是構成E3泛素連接酶復合體的關鍵分子(Jiangetal.，2015；Strandetal.，2018)。在復合體中，Cullin1蛋白可通過skp1調控f-box蛋白，由f-box蛋白與特定底物接觸，并以特異的方式降解底物蛋白，進而發揮其對信號轉導和細胞生理功能的調控作用(Chenetal.，2012)。E3泛素連接酶復合體是TGF-β信號通路活化的重要調控因素(Imamuraetal.，2013；Huangetal.，2016)，提示作為TGF-β信號通路的下游分子tinp1基因也可能受到E3泛素連接酶復合體(包括cullin1基因)的影響，因此兩基因之間有可能通過TGF-β信號通路發生相互作用。

本研究利用RNAi技術敲減Djcullin1基因表達，運用qPCR、整體原位雜交技術及Western Blotting技術檢測了Djsmad2/3、Djsmad4及Djtinp1基因及其翻譯后蛋白水平的表達。敲減Djcullin1基因后qPCR結果顯示,TGF-β信號通路相關分子Djsmad2/3、Djsmad4及Djtinp1基因的mRNA水平明顯增高，整體原位雜交結果顯示，渦蟲體內Djsmad2/3、Djsmad4及Djtinp1基因表達較對照組渦蟲明顯增高，Western Blotting數據表明，Djcullin1基因干擾后渦蟲體內Smad2/3、Smad4及Tinp1蛋白的表達明顯調高。說明敲減Djcullin1基因可以增強TGF-β信號通路相關基因及蛋白的表達。利用RNAi技術敲減Djtinp1基因后，qPCR及整體原位雜交結果顯示渦蟲體內Djcullin1基因表達明顯增高，qPCR結果表明敲減Djtinp1基因后Djcullin1基因的表達水平增加了4.7倍，Western Blotting數據也表明,Cullin1蛋白水平明顯增高。

綜上所述，作為TGF-β信號通路Smad2/3的抑制因子，Djcullin1基因在日本三角渦蟲體內可通過TGF-β信號通路增強Djtinp1基因的表達，Djtinp1基因也可影響Djcullin1基因表達，兩者之間為負性調節機制，具體Djtinp1基因如何反向影響Djcullin1基因表達，目前原因還不清楚。由于目前未見任何有關cullin1基因、TGF-β信號通路及tinp1基因相關互作的報道，所以上述創新性發現可為研究三角渦蟲的再生機制提供新的理論視角。但本課題僅研究了Djcullin1和Djtinp1基因在日本三角渦蟲體內的相互作用，并未涉及哺乳動物和人類，因此2個基因的互相調節作用是否普遍存在于其他生物體內還不清楚，仍有待深入研究。