氫化諾卜基雙子季銨鹽的合成及抑菌活性

2021-03-23 06:43:28馮雪貞肖轉泉范國榮王宗德

生物質化學工程 2021年2期

馮雪貞,肖轉泉,范國榮,王宗德*

(1. 江西農業大學林學院,國家林業草原木本香料(華東)工程技術研究中心,江西南昌 330045； 2. 江西師范大學化學化工學院,江西南昌 330027)

季銨鹽化合物是一類陽離子表面活性劑,具有水溶性較好、化學性能穩定、使用方便、低毒高效、廣譜抗菌等優點[1],已得到廣泛應用,包括用作植物病原菌的抗菌劑[2-3]。雙子季銨鹽由于分子內含有兩個親水基和親油基而具有優異的表面性能和水溶性,被譽為新一代陽離子表面活性劑[4]。松香基雙子季銨鹽表面活性劑亦有報道[5-7]。作者所在課題組長期從事松節油主成分β-蒎烯的深加工研究,合成了氫化諾卜基鹵代物[8]、含氫化諾卜基的叔胺[9]以及含氫化諾卜基的單季銨鹽[10-12]等,發現部分單季銨鹽化合物對植物病原菌有良好的抑制活性。本研究在課題組前期研究的基礎上,以松節油主成分β-蒎烯制備的氫化諾卜基二甲基胺(氫化諾卜基的叔胺)為原料,將其與α,ω-二氯烷烴發生親核取代反應,合成得到含氫化諾卜基的雙子季銨鹽化合物,并測試其抗植物病原菌活性,旨在為天然可再生優勢生物質資源松節油的深度開發利用提供新的途徑。

1 實驗

1.1 試劑、菌種與儀器

氫化諾卜基二甲基胺(純度>95%),參照文獻[13]制備；1,4-二氯丁烷、1,5-二氯戊烷、1,6-二氯己烷、石油醚(30～60 ℃)和乙酸乙酯均為市售分析純；百菌清為標準品(純度≥98%)。

AmaZon SL質譜儀，德國Bruker Daltonics公司；AVANCE400 型核磁共振儀，瑞士Bruker公司；44X- 6T 顯微熔點測定儀，上海光學儀器六廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-ID型無菌超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；GHP-250型智能培養箱，上海三發科學儀器有限公司。

植物病原菌:水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris),油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides),枇杷炭疽病菌(Colletotrichumacutatum),松枯梢病病原菌(Sphaeropsissapinea),七葉樹殼孢菌(Fusicoccumaesuli),采絨革蓋菌(Coriolusversicolor),煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae),綿腐臥孔菌(Poriavaporaria),西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum),9種菌種均由江西農業大學林學院森林保護教研室提供。

1.2 雙子季銨鹽的合成

1.2.1合成路線氫化諾卜基二甲基胺(1)分別與1,4-二氯丁烷、1,5-二氯戊烷、1,6-二氯己烷反應制得3種含氫化諾卜基的雙子季銨鹽(2a～2c),合成路線見圖1。

圖1 氫化諾卜基雙子季銨鹽的合成路線

1.2.2合成方法在150 mL錐形瓶中加入0.11 mol的氫化諾卜基二甲基胺、0.05 mol的α,ω-二氯代烷和50 mL乙酸乙酯,在65 ℃左右攪拌約3 d,冷卻,結晶(10 ℃),過濾并用石油醚洗滌3～5次,濾干后減壓干燥,得產物2a～2c。

1.3 結構表征

以TMS為內標,D2O為溶劑,用400 MHz核磁共振儀進行1H NMR和13C NMR分析；采用電噴霧電離源(ESI) 在液相色譜-質譜聯用儀上進行 ESI-MS 分析。

1.4 抑菌活性測試

用菌絲生長速率法[14-16]測定氫化諾卜基雙子季銨鹽對9種植物病原菌的抑制作用。以不含任何化合物的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基平板作為空白對照組,以百菌清為陽性對照。將季銨鹽用無菌水配制成質量濃度為2 g/L的溶液,通過二倍稀釋法將溶液配成1、 0.5、 0.25和0.125 g/L濃度梯度,將其與滅菌過的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養液以體積比1 ∶9混合,得到質量濃度為200、 100、 50、 25和12.5 mg/L 的含藥培養液,將含藥培養液倒入培養皿中,得到含藥液的平板,每個處理重復3次。接菌后置于25 ℃恒溫培養箱中培養數天,待空白對照組平板的菌落直徑生長到整個培養皿的三分之二左右,用十字交叉法測量菌落直徑(菌落直徑=菌落實際生長直徑-菌餅直徑),根據菌落直徑求抑制率,計算公式如下:

菌絲生長抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%

2 結果與討論

2.1 合成反應分析

叔胺與α,ω-二氯烷烴反應可得到雙子季銨鹽。為了保證二氯烷烴兩端都發生反應形成季銨鹽,叔胺的用量必須過量,以避免產物中夾雜尚有一端仍未季銨化的單季銨鹽,從而影響雙子季銨鹽的結晶和純度。由于合成過程中用的是氯代烷烴,與叔胺的反應活性不如溴代烷烴,所以有必要延長反應時間,使反應完全。

2.2 3種雙子季銨鹽的結構表征

化合物2a:四亞甲基-1,4-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨),C30H58N2Cl2,白色細粒狀結晶體,得率87.6%,m.p.252.9～254.5 ℃。1H NMR (400 MHz,D2O)δH: 3.30(8H,m,H-11,H-11′,H-12,H-12′),3.04(12H,s,H-α),2.33(2H,m,H-2,H-2′),1.99～1.80(20H,m,H-7-a,H-7′-a,H-10,H-10′,H-5,H-5′,H-1,H-1′,H- 4,H- 4′,H-3-a,H-3′-a,H-13,H-13′),1.44(2H,m,H-3-b,H-3′-b),1.17(6H,s,H-9,H-9′),1.01(6H,s,H-8,H-8′),0.87(2H,d,J=9.2 Hz,H-7-b,H-7′-b);13C NMR (100 Hz,D2O)δC:36.94(C-1,C-1′),44.44(C-2,C-2′),20.51(C-3,C-3′),24.81(C- 4,C- 4′),39.94 (C-5,C-5′),37.08(C- 6,C- 6′),28.51(C-7,C-7′),21.76(C-8,C-8′),26.57(C-9,C-9′),37.74(C-10,C-10′),61.98(C-11,C-11′),61.11(C-12,C-12′),18.19(C-13,C-13′),49.90(C-α,C-α,C-α,C-α);ESI-MSm/z:481.5,483.5[M-Cl]+,551.5,553.5,555.5[M+Cl]+。

化合物2b:五亞甲基-1,5-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨),C31H60N2Cl2,白色細粒狀結晶體,得率84.2%,m.p.258.4～260.7 ℃。1H NMR (400 MHz,D2O)δH:3.30(8H,m,H-11,H-11′,H-12,H-12′),3.04(12H,s,H-α),2.33(2H,m,H-2,H-2′),1.99～1.80(22H,m,H-7-a,H-7′-a,H-10,H-10′,H-5,H-5′,H-1,H-1′,H- 4,H- 4′,H-3-a,H-3′-a,H-13,H-13′,H-14),1.44(2H,m,H-3-b,H-3′-b),1.17(6H,s,H-9,H-9′),1.01(6H,s,H-8,H-8′),0.87(2H,d,J=9.2 Hz,H-7-b,H-7′-b);13C NMR(100 Hz,D2O)δC:37.08(C-1,C-1′),44.61(C-2,C-2′),20.92(C-3,C-3′),25.10(C- 4,C- 4′),40.16(C-5,C-5′),37.31(C- 6,C- 6′),28.52(C-7,C-7′),21.90(C-8,C-8′),26.86(C-9,C-9′),32.07(C-10,C-10′),61.47(C-10,C-11′),61.24(C-12,C-12′),21.53(C-13,C-13′),20.63(C-14),50.31(C-α,C-α,C-α,C-α); ESI-MSm/z:495.5,497.5[M-Cl]+,565.5,567.5,569.5[M+Cl]+。

化合物2c:六亞甲基-1,6-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨),C32H62N2Cl2,白色細粒狀結晶體,得率90.4%,m.p.264.2～265.3 ℃。1H NMR (400 MHz,D2O)δH: 3.26(8H,m,H-11,H-11′,H-12,H-12′),3.06(12H,s,H-α),2.33(2H,m,H-2,H-2′),2.04～1.77(20H,m,H-7-a,H-7′-a,H-10,H-10′,H-5,H-5′,H-1,H-1′,H- 4,H- 4′,H-3-a,H-3′-a,H-13,H-13′),1.43(6H,m,H-3-b,H-3′-b,H-14,H-14′),1.20(6H,s,H-9,H-9′),1.04(6H,s,H-8,H-8′),0.92(2H,d,J=9.6 Hz,H-7-b,H-7′-b);13C NMR (100 Hz,D2O)δC:36.97(C-1,C-1′),44.57(C-2,C-2′),20.89(C-3,C-3′),24.98(C- 4,C- 4′),40.07(C-5,C-5′),37.21(C- 6,C- 6′),28.49(C-7,C-7′),21.82(C-8,C-8′),26.74(C-9,C-9′),31.93(C-10,C-10′),61.67(C-11,C-11′),61.29(C-12,C-12′),24.27(C-13,C-13′),20.58(C-14,C-14′),50.18(C-α,C-α,C-α,C-α);ESI-MSm/z:509.5,511.5[M-Cl]+,579.6,581.6,583.6[M+Cl]+。

2.3 雙子季銨鹽的抑菌活性

3種含氫化諾卜基的雙子季銨鹽化合物在5種濃度下對9種植物病原菌的抑制率數據列于表1。從表中所列的抑制率數據可以看出,3種雙子季銨鹽化合物對綿腐臥孔菌的抑制率均為100%,抑菌率和百菌清相同；2b、2c在質量濃度為12.5 mg/L時和2a在25 mg/L時對松枯梢病病原菌、七葉樹殼孢菌、煙草黑脛病菌和西瓜枯萎病菌的抑制率,均高于百菌清在200 mg/L時的抑制率；2a和2c在質量濃度為25 mg/L時對枇杷炭疽病菌的抑制率也高于百菌清質量濃度為200 mg/L時的抑制率；3種化合物在5個不同質量濃度下對采絨革蓋菌的抑制率高于相應濃度下百菌清的抑制率；3種化合物在質量濃度200 mg/L時對油茶炭疽病菌的抑制率高于百菌清；在質量濃度為50 mg/L及以上時,3種化合物對水稻紋枯病菌的抑制率高于百菌清。