蜜蜂全腦解剖、腺體分離及不同日齡組織形態比較

魏俏紅 韓賓 吳帆 張旭鳳 孟麗峰 段香媛 馮毛 胡菡

（1 中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2 中國計量大學生命科學學院浙江省生物計量及檢疫檢驗重點實驗室，杭州 310018；3 山西農業大學（山西省農業科學院）園藝研究所，太原 030031）

蜜蜂（Apoidea）是一種社會性昆蟲，也是少數人工馴化的經濟昆蟲之一。一個正常蜂群由一只能生育的雌性蜂王、大量不育的雌性工蜂和一定數量的雄蜂組成，種群的生存和發展依賴于個體間的勞動分工和相互協作，所以群體內的信息交流十分復雜[1]。隨著人們對蜜蜂行為特點的認識和研究不斷深入，蜜蜂逐漸成為研究神經生物學、社會行為學、群體遺傳學等領域的新興模式生物[2]。

作為模式生物，蜜蜂具備其他一些模式生物不可比擬的優點。第一，蜜蜂腦相對簡單。腦是蜜蜂主要的感覺中心，是調控行為和生理活動的中樞，能夠接受和處理來自眼和觸角的神經刺激并形成相應指令。蜜蜂腦體積較小，大約只有100 萬個神經元[3]，僅僅是人類大腦的十萬分之一[4]。盡管蜜蜂的神經網絡復雜性有限，但其神經元間的信息交流機制幾乎與脊椎動物相同[5]。而與模式生物果蠅相比，蜜蜂腦雖然只有果蠅腦的4 倍，但行為卻比獨居的果蠅復雜的多，所以蜜蜂更適合用于神經生物學機制研究[4]。第二，個體遺傳背景可以控制。在蜜蜂育種和科研中，蜂王人工授精技術已十分成熟[6]，研究人員容易獲得遺傳性狀穩定可控的個體，使得科學研究可以持續進行。第三，對蜜蜂感官、導航和通訊等相關的行為學研究已經有了長足的發展[7]，獲得了很多有用的行為學知識，這有利于深入研究神經信號與行為的關系。第四，生活史短，且易于飼養。蜜蜂工蜂從卵發育到成蟲只需21 天，且蜂王每日產卵近千枚，科研人員可以獲得大量實驗樣本[8]。因此，蜜蜂作為模式生物，特別是作為研究神經生物學的模式生物具有重要意義。

對于腦科學實驗，全腦解剖是研究的第一步。蜜蜂腦較小，整個頭部更是不足1mm3，總量小于1mg，且蜜蜂腦柔軟，外周被幾丁質外殼包裹[9]，完整解剖難度較大，相關的解剖技術發展緩慢且報道很少。Guy Bloch 等報道在干冰下進行解剖，但沒有給出詳細步驟[10]。Norman L Carreck 等和趙元洪等盡管介紹了蜜蜂腦解刨方法，但沒有涉及腦部亞區以及腦部腺體的分離[11,12]，而蜜蜂腦由前腦、中腦和后腦三部分組成。前腦包括蘑菇體和中央復合體等高級中樞，控制學習、記憶和運動等高級神經活動；中腦包含觸角葉，是嗅覺神經中心，接受和傳遞各種信息素和外界氣味物質的信號；而后腦通常不發達，主要包括內分泌神經元和控制進食與消化的運動神經元[13-15]，所以解剖分離各個腦區和腦部腺體對準確收集樣品，進而深入研究不同腦區和腺體的功能至關重要。

因此，在前人的基礎上，我們希望通過改進解剖方法，探索更加快速而完善的技術，一方面使解剖速度加快，減少樣品核酸和蛋白等成分的降解以保證樣品的有效性，另一方面一次性分離保證蜜蜂腦各組織和分區的腺體更加完整，這項技術將為蜜蜂或其他昆蟲腦科學研究提供幫助。本實驗將此項解剖技術應用于出房蜂、哺育蜂和采集蜂工蜂腦、腦亞區和腦部腺體的取樣，分析不同發育期蜜蜂腦區的形態差異。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

體式顯微鏡1 臺（上海締倫光學儀器有限公司；締倫XTL-206A 三目連續變倍體視顯微鏡）、蠟盤1個（將熔化的蜂蠟過濾后倒入培養皿）、尖頭鑷子2把（中鏡科儀：型號5-SA）、普通載玻片、100 微升移液器（Thermo Finnpipette；F3）、昆蟲針2 根、蛋白酶/RNA 酶抑制劑PBS 溶液。

1.2 取樣

本實驗所用蜜蜂均來自中國農業科學院8 號樓樓頂蜂場。所取樣品分3 個日齡，分別為出房蜂、哺育蜂、采集蜂。從蜂箱中取出一張即將出房的子脾放到培養箱（溫度34℃，濕度70%～85%）過夜，第二天抓取出房<24h 的蜜蜂作為出房蜂；哺育蜂是將剛出房的蜜蜂用油漆筆標記，待10日齡抓取；采集蜂是在蜂箱口抓取后足攜帶花粉的蜜蜂。將新取回的蜜蜂用CO2麻醉；鑷子、載玻片、顯微鏡用酒精擦拭消毒；然后在載玻片上滴加20 微升蛋白酶/RNA 酶抑制劑溶液，放置在冰盒中備用。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂腦解剖

取新鮮蜜蜂或CO2麻醉后，首先把蜜蜂正面放在蠟盤上，用兩根昆蟲針傾斜穿過胸部將蜜蜂固定在蠟盤上（圖1）。

解剖過程主要分三個步驟：（1）劃開腦部幾丁質：用左手鑷子夾住蜜蜂腦部，使其固定不動（圖2），用右手鑷子在蜜蜂腦部外圍復眼處扎一小孔（圖3），然后在小孔處沿著外圍將幾丁質劃開（圖4）；（2）去除上部幾丁質：左手鑷子夾住喙幾丁質邊緣，右手鑷子夾住劃開處幾丁質外殼（圖5），向上掀起腦部上方幾丁質，并挑起觸角處的幾丁質（圖6）；（3）取出腦部：掀掉上部幾丁質后，腦部組織完全暴露出來（圖7），右手鑷子水平從蜜蜂腦后下方插入托起腦部組織（圖8），使整個腦部組織完全位于鑷子上方，再用鑷子輕輕抬起，即可得到完整的腦組織，將獲得的腦組織轉移到載玻片上，放入準備好的抑制劑溶液中，預備進行下一步腺體和腦亞區的分離。

圖1 固定蜜蜂（15X）

圖2 左手鑷子夾住頭部（15X）

圖3 右手鑷子在復眼上部扎一小孔（20X）

圖4 從小孔處向左右劃開幾丁質（15X）

圖5 揭起腦殼上部（20X）

圖6 掀掉腦殼（15X）

圖7 揭去腦殼后（20X）

圖8 取出大腦（20X）

1.3.2 蜜蜂腦亞區分離

將已經取出的腦部組織放在滴有蛋白酶/RNA 酶抑制劑溶液的載玻片上（圖9），首先一次性分離左、右兩側復眼，避免復眼破裂內容物流出使其他區域染上顏色；再剝離覆蓋于腦部外層的白色膜；將兩側的視網膜分離，即可將兩側的視神經葉取出（圖10A）；去掉上側單眼處物質，即可得到蘑菇體（圖10B），嗅神經葉位于磨菇體下部，去掉磨菇體后剩余部分即為嗅神經葉，去掉周圍少量的其他組織，就可得到完整干凈的嗅神經葉（圖10C）。

圖9 完整的蜜蜂大腦（20X）

圖10 蜜蜂腦模擬圖（A 視神經葉，B 磨菇體，C 觸角神經葉）

圖10 蜜蜂腦分區（A 視神經葉，B 蘑菇體，C 觸角神經葉）（20X）

圖11 取出上顎腺（20X）

1.3.3 上顎腺、咽下腺和唾液腺的分離

上顎腺（Mandibular gland）位于腦部內上顎上面，是一對囊狀體，開口于上顎基部兩側。上顎懸掛于頭部口的兩端，緊接在上唇基部后面。上顎基部處有一凹窩為上顎腔，有前后兩個關節聯系點與頭部相連，并有兩條肌肉附著于活動軸的兩對面，使得上顎能左右活動。解剖時，掀掉蜜蜂腦部幾丁質后，挑開連接在蜜蜂喙處上方的多余幾丁質外殼，夾住頭部，再用鑷子夾住上顎腺體外的部位，輕輕拔出即可（圖11）。

咽下腺（Hypopharyneal glands）是位于蜜蜂頭部的一對外分泌腺體，覆蓋在蜜蜂腦上方（圖9），又稱舌腺、營養腺或蜂王漿腺。咽下腺共有兩條，每條腺體由一條長而呈葡萄狀的腺泡組成，腺泡產生白色或淡黃色的蛋白質分泌物——蜂王漿。取咽下腺時，要先將復眼去掉，以免取出咽下腺時復眼破裂液體流出污染咽下腺和其他組織；用鑷子夾住咽下腺輕輕一拉便可拉出整條咽下腺，再將黏附于咽下腺的雜質去掉，就可得到干凈的蜜蜂咽下腺組織（圖13）。

唾液腺（Salivary glands）共兩對，分別為頭唾腺和胸唾腺。頭唾腺位于蜜蜂頭部背側復眼底部左右各一串，通常與咽下腺纏繞在一起。頭唾腺的形態與咽下腺有明顯差別，解剖時只需在剝離咽下腺后，從中拉出唾液腺即可（圖14）。

2 結果

2.1 腦分區

蜜蜂視神經葉（Optic lobe，OL）位于腦部兩側，體積相對較大，基本占蜜蜂腦體積一半以上，實驗中最先分離。首先去除復眼視網膜結構，然后用鑷子直接剝離視神經葉。

觸角神經葉（Antennal lobe，AL）位于蜜蜂腦的正前方，類似于球狀結構，是連接蜜蜂觸角的區域，也是蜜蜂的初級嗅覺中樞，主要接收來自觸角的氣味信息，再將信息傳遞給蘑菇體[16]。由于觸角神經葉較小，容易丟失，解剖過程中必須保證腦部組織的完整取出才能獲得該部分。

蜜蜂的蘑菇體（Mushroom body，MB）約占大腦總體積的19%，共含有約36800 個神經元，占大腦神經元的40%，是蜜蜂的高級中樞[17]。蘑菇體呈杯狀結構，又分成幾個部分，解剖時要保證其完整性。

2.2 上鄂腺

對出房蜂、哺育蜂和采集蜂上顎腺比較發現，出房蜂上顎腺體呈透明狀，腺體內容物較少；哺育蜂上顎腺腺體飽滿呈淡黃色，內容物多；采集蜂上顎腺腺體也呈黃色，干癟且內容物少（圖12）。

圖12 蜜蜂不同日齡上顎腺（A 出房蜂，B 哺育蜂，C 采集蜂）（20X）

2.3 咽下腺

不同日齡工蜂的咽下腺發育程度不同，剛出房的工蜂咽下腺發育不完全，腺體較小，腺泡透明，顏色呈白色（圖13A）；哺育蜂咽下腺腺泡飽滿、圓潤，顏色呈淡黃色（圖13B）；采集蜂咽下腺腺泡較小，內容物少，外觀較干癟，顏色呈深黃色（圖13C）。

圖13 蜜蜂不同日齡咽下腺（20X）

2.4 唾液腺

出房蜂唾液腺與上顎腺、咽下腺發育階段形態一致都較干癟，內容物少，腺泡呈透明狀；哺育蜂唾液腺形態與出房蜂相比變化不顯著；而采集蜂唾液腺腺泡內容物增多，顏色呈淡黃色（圖14）。

圖14 蜜蜂不同日齡唾液腺（20X）

3 討論

3.1 影響蜜蜂解剖效率的因素

高效完整的蜜蜂解剖為更加精準的研究提供了重要的基礎。對于大部分昆蟲來說，它們體積小，結構復雜，解剖更是一項具有挑戰的任務。蜜蜂頭部不足1mm3，總量小于1mg，切下解剖并不容易操作。在此，我們通過改進方法，探索出了更加簡單和完整的解剖技術。

精準的解剖步驟決定樣品質量。實驗前應將蜜蜂使用CO2麻醉，麻醉后放置到冰盒中以防止蜜蜂蘇醒。在解剖過程中固定蜜蜂也很重要，固定蜜蜂應該選用兩根昆蟲針從蜜蜂胸部兩側傾斜插入，這樣的固定不影響后續的解剖[18]。實驗中好的解剖工具能夠達到事半功倍的效果，尤其是劃幾丁質用的鑷子，尖銳且較硬質的鑷子較為順手，容易劃開幾丁質，解刨用時最短樣品質量越好。同時，經過長期冷凍或在室溫久置的蜜蜂不易解刨；鮮活的未經過冷凍處理的蜜蜂，解剖蜂腦會更加容易，組織更加完全。在解剖蜂腦的過程中，應注意不要劃破復眼，因為復眼內物質色深且易流出污染其他組織；正常操作時，鑷子會觸碰到幾丁質，將頭部絨毛和雜物帶入，為避免污染，應及時用酒精棉擦拭干凈。

3.2 不同日齡蜜蜂腦部組織存在區別

作為社會性昆蟲，不同日齡的蜜蜂功能不同，所以發育階段不同的蜜蜂腦在形態學上必然存在差異。為此，我們對工蜂出房蜂、哺育蜂和采集蜂腦部組織進行了多方面比較。從外部看，出房蜂、哺育蜂和采集蜂腦部大小沒有明顯差異。但是，解剖時發現它們的幾丁質外殼硬度不同。幾丁質也稱殼多糖（chitin），為N-乙酰葡糖胺通過β連接聚合而成的結構同多糖，主要是用來作為支撐身體的骨架，以及對身體起保護的作用[19]。出房蜂腦幾丁質外殼較軟，而哺育蜂和采集蜂幾丁質堅硬，說明隨著發育，蜜蜂腦殼逐漸變硬。幾丁質外殼成分和結構隨著日齡變化，這在蜜蜂寄生蟲狄斯瓦螨中已有報道，即螨類在發育不同階段利用不同的幾丁質結構蛋白。但這種機制在蜜蜂中還沒有相關研究。

剖開腦殼從內部看，工蜂出房蜂、哺育蜂和采集蜂腦內部組織狀態也不同。整體來說，出房蜂腦內部體積較小，組織不飽滿，顏色呈乳白色；哺育蜂腦內部腺體發達，各部位飽滿，顏色呈淡黃色，腦部組織與咽下腺相比較小；采集蜂腦內部開始萎縮，腺體干癟，咽下腺腺體呈深黃色。相比于采集蜂，出房蜂和哺育蜂腦內水分含量較高。

其次對蜜蜂腦各個亞區進行比較。蜜蜂腦亞區主要包括蘑菇體、視神經葉和觸角神經葉三部分，蘑菇體是蜜蜂的高級中樞[17]。接收和處理來自外界的所有刺激，視神經葉和觸角神經葉的信號最終都要經過蘑菇體處理，然后反饋或形成穩固的記憶。視神經葉主要接收和處理來自復眼的光信號，觸角神經葉是蜜蜂的初級嗅覺中樞，主要接收來自觸角的氣味信息。三者功能明顯不同，所以成功分離各個亞區對于深入研究局部功能有著重要作用，如：對中華蜜蜂和意大利蜜蜂上述三個亞區蛋白質組比較發現，蘑菇體中蛋白質主要對突觸的塑造和長期記憶的形成具有重要作用，視神經葉上核糖核酸作為第二信使在視覺傳導中起重要作用，而兩者觸角神經葉的蛋白質功能的顯著差異才是決定中華蜜蜂嗅覺更加靈敏的原因[20]。但是蜜蜂腦各個亞區體積太小，在體視鏡下沒有觀察到三個時期蜜蜂蘑菇體、視神經葉和觸角神經葉等亞器官有何差異，需要進一步通過生物學方法進行分析。

3.3 蜜蜂腺體的形態與其功能和日齡直接相關

上顎腺是蜜蜂重要的外分泌腺體，其分泌物是維系蜂群社會性結構的重要物質。雖然工蜂和蜂王的上顎腺結構相似，但其分泌物的組成和功能差別極大[21]。蜂王上顎腺主要參與蜂王信息素的合成，包括9-ODA、順-9-HDA、反9-HDA 以及10-HDA等物質，它們在蜂群發展和群內調控中發揮極其重要的作用。工蜂上顎腺分泌物的信息素類功能并不突出，而在蜂群營養等方面發揮著關鍵作用，例如在哺育蜂時期參與蜂王漿的合成[20]，因而腺體飽滿充滿內容物。

不同日齡蜜蜂咽下腺的形態不同，這與蜜蜂勞工分配密切相關。咽下腺是分泌蜂王漿的主要器官，這是哺育蜂的主要職能[22]。哺育蜂的主要任務是飼喂幼蟲，它們的咽下腺十分發達，即使都是哺育蜂，哺育能力強的工蜂咽下腺也比哺育能力弱的哺育蜂腺體發達[23]。6～12日齡的工蜂，其咽下腺發育基本成熟，分泌活動最強，是分泌王漿高峰期[24]。隨著工蜂日齡的增加，到達采集蜂時期，其咽下腺逐漸萎縮退化，咽下腺已經失去分泌蜂王漿的能力[25]。但是，工蜂咽下腺的發育卻是可逆的，或者說工蜂咽下腺發育不受日齡的限制[26]。研究表明，蜂群中缺少哺育蜂時，采集蜂會逆轉為哺育蜂并飼喂幼蟲，三天后其咽下腺活性增強[27]；而在無幼蟲的蜂群中，哺育蜂的咽下腺雖然正常發育，其生理功能與越冬蜂群相似[28]。咽下腺發育的調節機制需要深入研究，所以完整解剖對后續研究具有重要意義。

蜜蜂頭部唾液腺在不同日齡時期的形態變化與咽下腺和上顎腺卻不完全一樣，這與唾液腺的腺體功能和蜜蜂的社會勞動分工密切相關。唾液腺在采集蜂時期形態飽滿，腺體發育成熟，這是由于蜜蜂在采集蜂時期外出采集花粉、花蜜，唾液腺需要分泌大量的唾液進入花粉和花蜜。唾液中的轉化酶將花蜜主要的蔗糖轉化為葡萄糖和果糖[29]。

4 結論

本研究改進了蜜蜂腦部組織解剖的操作方法，一次性獲得多個組織如：咽下腺、上顎腺、蘑菇體、視神經葉、嗅神經葉等，提高了解剖效率，也降低了實驗樣本的需求，為不同的研究工作提供優質的組織樣品。本方法使用的解剖工具簡單，只需要兩把尖頭鑷子就可完成整個操作步驟。縮短了操作時間，還有效保證了組織樣品中信息的完整，這也為蜜蜂的后續研究提供了有力的技術支撐。同時，初步比較了不同日齡工蜂主要腺體和腦亞區差異，這對進一步研究蜜蜂腦有一定幫助。