哮喘患兒外周血單個核細胞瘦素與RORγt和Foxp3表達的關系

柳菊芬 沃小敏 潘陽 李明安

【摘要】 目的：探討哮喘患兒外周血單個核細胞（PBMC）分泌的瘦素水平變化及其與Th17特異性轉錄因子維甲酸相關孤兒核受體γt （RORγt）和Foxp3+調節性T細胞（Treg）特異性轉錄因子叉頭狀轉錄因子p3（Foxp3）表達的關系。方法：選取2018年6月-2020年6月本院收治的25例哮喘患兒設為哮喘組。根據哮喘組患兒疾病所處的時期不同，分為發作期和緩解期。對哮喘發作期兒童經規則聯合吸入糖皮質激素/長效β2受體激動劑（ICS/LABA）治療后定期隨訪，無癥狀和體征超過3個月以上作為緩解期。選取同期在本院體檢25例的健康兒童為對照組。比較哮喘組發作期和緩解期及對照組的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表達水平，并分析哮喘組發作期患兒瘦素與PBMC的FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及RORγt mRNA與Foxp3 mRNA的相關性。結果：對照組、哮喘組發作期和緩解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均有統計學意義（P<0.01）。哮喘組發作期的瘦素、RORγt mRNA相對表達量均高于對照組和哮喘組緩解期，FEV1%、Foxp3 mRNA均低于對照組和哮喘組緩解期，差異均有統計學意義（P<0.01）。對照組和哮喘組發作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均無統計學意義（P>0.01）。哮喘組患兒發作期PBMC培養上清液瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA呈正相關（r=0.884，P<0.01）;與PBMC的Foxp3 mRNA呈負相關（r=-0.926，P<0.01）;與FEV1%呈負相關（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA與RORγt mRNA呈負相關（r=-0.854，P<0.01）。結論：哮喘患兒PBMC分泌的瘦素與RORγt mRNA呈正相關，與Foxp3 mRNA呈負相關。

【關鍵詞】 瘦素 哮喘 外周血單個核細胞 維甲酸相關孤兒核受體γt 叉頭狀轉錄因子p3

[Abstract] Objective： To investigate the levels of leptin derived by the peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and the effect on RORγt （the transcription factor of Thl7 cells） and Foxp3 （the transcription factor of Foxp3+Treg cells） in children with asthma. Method： A total of 25 children with asthma admitted to our hospital from June 2018 to June 2020 were selected as the asthma group. According to the different period of the asthma group， the children were divided into attack stage and remission stage. Children in attack stage of asthma would be followed up regularly after regular treatment with inhalationcorticosteroid/long-acting β2 receptor agonists （ICS/LABA）， with no symptoms or signs for more than 3 months as the remission period. A total of 25 healthy children who underwent physical examination in the same period were selected as the control group. The levels of leptin， FEV1， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in the attack and remission stages of the asthma group and the control group were compared during attack and remission period. The correlation between leptin and FEV1， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in PBMC and between RORγt mRNA and Foxp3 mRNA of asthmatic group were analyzed. Result： There were no significant differences in the levels of leptin， FEV1%， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in the attack and remission stages of the asthma group and the control group （P<0.01）. The levels of leptin and RORγt mRNA in the attack stage of asthma group were higher than those of control group and asthma group at remission stage， and the levels of FEV1% and Foxp3 mRNA were lower than those of control group and asthma group at remission stage， the differences were statistically significant （P<0.01）. There were no significant differences in the levels of leptin， FEV1%， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA between control group and the asthma group at remission stage （P>0.01）. There was positive correlation in the attack stages of the asthma group between the concentration of leptin in the supernatant of PBMC culture and the RORγt mRNA in PBMC （r=0.884， P<0.01）; and PBMC Foxp3 mRNA was negatively correlated （r=-0.926， P<0.01）; FEV1% was negatively correlated （r=-0.936， P<0.01）; Foxp3 mRNA was negatively correlated with RORγt mRNA （r=-0.854， P<0.01）. Conclusion： The leptin secreted by PBMC in asthmatic children was positively correlated with RORγt mRNA and negatively correlated with Foxp3 mRNA.

[Key words] Leptin Asthma Peripheral blood mononuclear cells RORγt Foxp3

First-author’s address： Shuyang People’s Hospital， Shuyang 223600， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.17.016

支氣管哮喘是由多因素共同作用、多種細胞及其細胞因子共同參與的呼吸道慢性炎癥性疾病。肥胖是支氣管哮喘的危險因素之一，且呈劑量依賴性[1-4]。瘦素為脂肪組織分泌的一種激素，其結構與IL-6、IL-12、G-CSF等細胞因子相似，參與機體的免疫調節，尤其在機體能量調節中起著重要的作用，在哮喘發病過程中也起著重要作用[5]。Th17是胸腺來源的CD4+ T細胞，Th17細胞以分泌白介素17（IL-17）為特征，其上游調控基因為維甲酸相關孤兒核受體γt （RORγt），Treg具有免疫調節和維持機體免疫耐受的作用，目前認為其上游調控基因主要為叉狀頭轉錄因子p3（Foxp3）[6-7]。Th17和Treg在分化和功能上相互抑制，兩者失衡與多種自身免疫性疾病有關，研究表明，哮喘的發病與Th1/Th2失衡有關[8-9]。但大量的研究表明哮喘的發病機制并不能簡單地用Th1/Th2失衡機制來解釋，在哮喘的發病過程中，Th17與Treg及其分泌的細胞因子也參與其中，因此Th17/Treg失衡也可能是哮喘發病機制之一，哮喘發病過程中不僅有Th1/Th2的失衡，也可能同時存Th17/Treg的失衡。

本研究分離哮喘患兒外周血單個核細胞并培養，檢測其上清液瘦素的濃度值，采用PCR法分別檢測Th17與Foxp3+ Treg上游特異性轉錄因子RORγt、Foxp3 mRNA相對表達量，并分析瘦素與RORγt、Foxp3 mRNA表達的相關性，以探討瘦素在哮喘發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月-2020年6月本院收治的25例哮喘患兒設為哮喘組。納入標準：（1）哮喘的診斷符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》（2008版）[10];（2）經治療后緩解期隨訪數據完整。排除標準：（1）合并肺結核、支氣管肺炎等呼吸道疾病;（2）合并腎小球腎炎、風濕性疾病等免疫性疾病;（3）合并惡性腫瘤;（4）就診前1個月應用過免疫抑制劑。選取同期在本院體檢的25例健康兒童為對照組，納入標準：體檢顯示健康。排除標準：依從性差、不配合。根據哮喘組患兒疾病所處的時期不同，分為發作期和緩解期。對哮喘發作期兒童經規則聯合吸入糖皮質激素/長效β2受體激動劑（ICS/LABA）治療后定期隨訪，無癥狀和體征超過3個月以上作為緩解期。本研究經醫院倫理委員會批準，所有入組兒童監護人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 BMI的測定 測量所有入選兒童的身高和體重，并計算其體質指數（BMI），BMI=體重（kg）/身高2（m2）。

1.2.2 外周血的采集及單個核細胞的分離和培養 哮喘組患兒發作期于治療前采集外周血，哮喘組緩解期于緩解期采集外周血，對照組于體檢時采集外周血。均空腹采集靜脈血5 mL，三組標本均用肝素鈉抗凝，采用Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液分離得人外周血單個核細胞，同時分離血漿于（-80 ℃）保存待測。將分離的外周血單個核細胞用1640培養液（培養液內含有10%胎牛血清）重懸后接種于24孔板（每孔0.5 mL），終濃度為2×106/mL。加入anti-CD28（2 mg/L）、anti-CD3（10 mg/L）抗，鏈霉素（100 μg/mL）、青霉素（100 U/mL），放置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養72 h，收集培養上清液于（-80 ℃）保存待測，并收集細胞。

1.3 觀察指標 比較哮喘組發作期和緩解期及對照組的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表達水平，并分析哮喘組患兒發作期瘦素濃度與PBMC的FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及RORγt mRNA與Foxp3 mRNA的相關性。（1）PBMC中RORγt mRNA及Foxp3 mRNA的測定。采用Invitrogen公司的TRIzol Reagen試劑提取單個核細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA（東洋紡試劑盒），合成的cDNA于（-80 ℃）中保存備用，以提取的cDNA為模板。用CFX 96熒光PCR儀，按照Bio-Rad Sybr Green Super Mix說明書要求，以GAPDH為內參測定RORγt及Foxp3的相對表達量，每個標本擴增三次，然后算其均值。擴增所用引物序列，RORγt上游引物為：5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’，下游引物為：5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’;Foxp3上游引物為：5’-GAAGCAGCGGACACTCAATG-3’，下游引物為：5’-AGGTGGCAGGATGGTTTCTG-3’;GAPDH上游引物為：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物為：5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。根據標準曲線計算RORγt、Foxp3及GAPDH的Ct值，以GAPDH為內參校準Foxp3的相對表示達量，結果分別用RORγt/GAPDH mRNA及Foxp3/GAPDH mRNA相對值來表示。（2）瘦素的檢測。酶聯免疫吸附測定法檢測外周血單個核細胞培養上清液的瘦素濃度（試劑盒由R&D system公司提供），具體操作過程按試劑說明書的要求進行，用酶標儀（生產廠家：Bio-Tek Instruments，型號：uQuant）讀取吸光度值，用試劑盒標準曲線來計算相應吸光值的瘦素濃度。（3）FEV1的檢測。兒童FEV1與年齡相關，本研究采用（實際值/預計值）×100%（FEV1%）表示。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，三組數據比較用方差分析，兩組數據比較采用t檢驗。以P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 哮喘組男14例，女11例，平均年齡（8.20±2.16）歲，平均BMI（17.11±3.52）kg/m2。對照組男14例，女11例;平均年齡（8.32±2.32）歲，平均BMI（17.21±3.45）kg/m2。兩組一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組外周血單個核細胞培養上清液所測瘦素的濃度及外周血單個核細胞中RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達量的比較 對照組、哮喘組發作期和緩解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均有統計學意義（P<0.01）。哮喘組發作期的瘦素、RORγt mRNA相對表達量均高于對照組和哮喘組緩解期，FEV1%、Foxp3 mRNA均低于對照組和哮喘組緩解期，差異均有統計學意義（P<0.01）。對照組和哮喘組發作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均無統計學意義（P>0.01）。見表1。

2.3 哮喘組患兒發作期瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及FEV1%的相關性分析 采用直線回歸相關性分析顯示，哮喘組患兒發作期PBMC培養上清液瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA呈正相關（r=0.884，P<0.01）;與PBMC的Foxp3 mRNA呈負相關（r=-0.926，P<0.01）;與FEV1%呈負相關（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA與RORγt mRNA呈負相關（r=-0.854，P<0.01）。見圖1～4。

3 討論

哮喘是氣道慢性炎癥伴隨高通反應的可逆性氣道阻塞性疾病，通常認為Th1/Th2細胞失衡是其發病的主要機制。哮喘患者Th1型免疫反應減弱，Th2細胞免疫應答增強，Th2細胞分泌的IL-4、IL-5等細胞因子能增加IgE，并能促進嗜酸性粒細胞浸潤，是哮喘氣道炎癥的主要因素[11]。有研究顯示，并非所有哮喘都向Th2分化偏移，不能簡單地用Th1/Th2失衡來解釋哮喘的發病機制，Th1細胞增加反而可能加重哮喘癥狀[9]。胡斯明等[12]研究發現哮喘小鼠Treg/Th17顯著低于對照組，且與細胞因子相關，提示了哮喘的發病機制也可能和Treg/Th17的失衡機制相關。施宇衡等[13]研究表明，具有特征性轉錄因子的Th17細胞及其細胞因子在哮喘發病中起重要作用，這些都證明了Treg、Th17參與了哮喘的發病機制。本研究結果顯示，對照組、哮喘組發作期和緩解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均有統計學意義（P<0.01）。哮喘組發作期的瘦素、RORγt mRNA相對表達量均高于對照組和哮喘組緩解期，FEV1%、Foxp3 mRNA均低于對照組和哮喘組緩解期，差異均有統計學意義（P<0.01）。對照組和哮喘組發作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均無統計學意義（P>0.01）。而RORγt與Foxp3分別為Th17和Foxp3+ Treg的上游調控基因，因此RORγt mRNA和Foxp3 mRNA表達失衡可能是導致哮喘患兒Th17/Treg失衡的主要機制。

哮喘的發病機制比較復雜，瘦素通過何種途徑參與其發病機制目前尚不清楚[14]。但有研究表明肥胖哮喘患者，癥狀較重且療效差，血清高瘦素濃度可增加小兒哮喘的發病風險[15-16]。本研究顯示，哮喘組患兒發作期PBMC培養上清液瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA呈正相關（r=0.884，P<0.01）;與PBMC的Foxp3 mRNA呈負相關（r=-0.926，P<0.01）;與FEV1%呈負相關（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA與RORγt mRNA呈負相關（r=-0.854，P<0.01）。表明哮喘患兒急性期外周血單個核細胞分泌的瘦素增加，且與肺功能損傷密切相關。可見PBMC分泌的瘦素在哮喘發病機制中起重要作用。瘦素可通過抑制Treg的功能而導致哮喘的發生[17]。有研究對有瘦素基因或瘦素受體基因缺陷的小鼠進行瘦素阻斷，發現能夠延緩小鼠自身免疫性腦脊髓的發展[18]。有研究表明，人外周血單個核細胞培養，瘦素能增加Th17的數量并呈劑量依賴性[19]。因此可以推測在哮喘發病機制中瘦素也能參與Th17/Treg平衡的調節。本研究結果顯示，哮喘患兒急性期PBMC培養上清液中的瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA呈正相關與PBMC的Foxp3 mRNA呈負相關，瘦素的結構與白介素-6相似，白介素-6能調節Treg/Th17的平衡，因此哮喘患兒PBMC來源的瘦素也可能對Treg/Th17的平衡起重要的調節作用[20]。有研究在培養液加瘦素抗體，結果PBMC的Foxp3的表達量顯著增高，表明瘦素可通過對RORγt與Foxp3表達的調節參與對Th17/Treg平衡的調節[21]。

Th17和Treg在分化和功能上相互抑制，其分化成熟主要受其上游轉錄因子RORγt和Foxp3的調控[6，22]。而本研究結果顯示，PBMC分泌的瘦素參與了哮喘患兒RORγt mRNA和Foxp3 mRNA平衡的調節，提示其對Th17/Treg平衡也起重要調節作用，可能的機制是瘦素通過介導RORγt的表達從而增加Th17致病作用;通過抑制Foxp3的表達，進而抑制了Treg的免疫調節作用。

綜上所述，哮喘患兒PBMC分泌的瘦素與RORγt mRNA呈正相關，與Foxp3 mRNA呈負相關。

參考文獻

[1] Sood A.Obesity，adipokines，and lung disease[J].Journal Appl Physiology，2010，108（3）：744-753.

[2] Papoutsakis C，Priftis K N，drakouli M，et al.Childhood overweight/obesity and asthma：is there a link？ A systematic review of recent epidemiologic evidence[J].Journal of the Academy of Nutrition & Dietetics，2013，113（1）：77-105.

[3] Barros R，Moreira R，Padrao P，et al.Obesity increases the prevalence and the incidence of asthma and worsens asthma severity[J].Clinical Nutrition，2017，36（4）：1068-1074.

[4]王琴，傅俊健，楊梅，等.兒童哮喘嚴重程度與體重指數、脂聯素和瘦素的關系[J].臨床肺科雜志，2021，26（1）：50-53.

[5]陳碧，韓方方，朱潔晨，等.香煙煙霧對支氣管哮喘大鼠氣道上皮瘦素表達的影響[J].國際呼吸雜志，2018，38（21）：1609-1615.

[6] Ray A，Khare A，Krishnamoorthy N，et al.Regulatory T cells in many flavors control asthma[J].Mucosal Immunology，2010，3（3）：216-229.

[7] Zhang M，Qian Y Y，Chai S J， et al.Enhanced local Foxp3 expression in lung tissue attenuates airway inflammation in a mouse model of asthma[J].Journal Asthma，2014，51（5）：451-458.

[8] Ivanov I I，Zhou L，Littman D R.Transcriptional regulation of Th17 cell differentiation[J].Seminars Immunology，2007，19（6）：409-417.

[9]時國朝，萬歡英.支氣管哮喘的免疫發病機制—從Th1/Th2細胞失衡到Th2/Treg細胞失衡[J].內科理論與實踐，2011，6（2）：92-95.

[10]中華醫學會兒科學分會呼吸組.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J].中華兒科雜志，2008，46（10）：745-753.

[11]劉曉菲，梁瀛，張叢溪，等.92例哮喘患者血清瘦素與誘導痰嗜酸性粒細胞的關系[J].山東大學學報（醫學版），2020，58（9）：27-33.

[12]胡斯明，羅雅玲，賴文巖，等.調節性T細胞/Th17在支氣管哮喘小鼠氣道炎癥過程中的變化[J].中國現代醫學雜志，2009，19（19）：2881-2884.

[13]施宇衡，時國朝，萬歡英，等.過敏性哮喘患者外周血Th17細胞及IL-17水平的變化[J].診斷學理論與實踐，2010，9（5）：473-476.

[14] Sole D.Obesity and asthma[J].Rev Paul Pediatr，2013，31（2）：136-137.

[15] Peters U，Dixon A E，Forno E.Obesity and asthma[J].Journal Allergy Clinical Immunology，2018，141（4）：1169-1179.

[16] Saboktakin L，Bilan N，Nikniaz A，et al.Study on serum Leptin level of children with asthma[J].Life Science Journal-Acta Zhengzhou University Overseas Edition，2012，9（4）：1415-1419.

[17] De Rosa V，Procaccini C，Cali G，et al.A key role of leptin in the control of regulatory T cell proliferation[J].Immunity，2007，26（2）：241-255.

[18] Matarese G，Carrieri P B，La Cava A，et al.Leptin increase in multiple sclerosis associates with reduced number of CD4+ CD25+ regulatory T cells[J].Proceedings National Academy Science USA，2005，102（4）：5150-5155.

[19] Yu Y，Liu Y，Shi F D，et al.Cutting edge：Leptin-Induced RORγt expression in CD4+ T cells promotes Th17 responses in systemic lupus erythematosus[J].Journal Immunology，2013，190（7）：3054-3058.

[20] Taflin C，Favier B，Baudhuin J，et al.Human endothelial cells generate Th17 and regulatory T cells under inflammatory conditions[J].Proceedings National Academy Science USA，2011，108（7）：2891-2896.

[21]李明安，司麗媛，吳紅波，等.哮喘患兒外周血單個核細胞瘦素及Foxp3的表達[J].現代檢驗醫學雜志，2016，31（4）：58-61，64.

[22] Chen Z，Lin F，Gao Y，et al.Foxp3 and RORγt：transcriptional regulation of Treg and Thl7[J].International Immunopharmacology，2011，11（5）：536-542.

（收稿日期：2021-04-02） （本文編輯：張明瀾）