基于網絡藥理學及分子對接探討“桂枝、附子、白術”治療類風濕關節炎的作用機制※

黃偉峰 廖發杰 陳光星

(廣州中醫藥大學第一臨床醫學院2020級碩士研究生，廣東 廣州 510405)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種炎癥性自身免疫性疾病，以累及周圍關節為主，以滑膜炎為基本病理改變[1]。其病變部位以手足小關節為主，表現為疼痛、腫脹及功能受限，嚴重者會導致軟骨破壞，造成關節畸形，甚至導致殘疾。現代醫學主要應用非甾體抗炎藥、糖皮質激素和改善病情抗風濕藥治療RA[2]，但是此類藥物對患者會造成一定的副作用。而中醫藥治療RA發揮重要作用，副作用較少，臨床應用廣泛。

中醫學對RA的認識歷史悠久，早在《內經》中己有與本病近似的疾病記載，RA屬痹證范疇，《素問·痹論》謂“風寒濕三氣雜至，合而為痹”。后世醫書中的“尪痹”“歷節病”“骨痹”及“鶴膝風”等與RA癥狀相似[3]。國醫大師路志正認為，RA主要病因病機為先天稟賦不足，素體正氣虧虛，營衛不固，感受風寒濕熱諸邪，或攝生不當感受非時之氣，邪襲經絡，留滯關節，氣血不暢，痰瘀互結，深入骨骱而發病[4]。

桂枝為肉桂干燥嫩枝入藥，味辛、甘，性溫，功效發汗解肌，溫通經脈，助陽化氣，平沖降逆。附子為烏頭子根入藥，味辛、甘，性大熱，有毒，功效回陽救逆，補火助陽，散寒止痛。白術為白術根莖入藥，味甘、苦，性溫，功效健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎[5]。《神農本草經》記載桂枝有“利關節，補中益氣”作用，而白術則“主風寒濕痹死肌，痙疸”，附子有治療“躄拘攣，腳痛，不能行步”的作用。《本草匯言》曰“白術，乃扶植脾胃，散濕除痹，消食除痞之要藥也”。魯賢昌教授認為，痹證之寒勝者可選用桂枝、附子，而濕勝者則可選白術酌情加減[6]。馬武開教授論治RA要重視脾胃，常用炒白術化濕邪，生氣血[7]。相關藥理研究表明，附子治療RA的機制與其抗炎、調節免疫等作用有關[8-9]。

中醫藥調治RA在改善癥狀方面有較大優勢。許飛等[10]通過回顧性分析 4028 例 RA 住院病例資料，認為RA 患者不同年齡段中醫證候分布均以風寒濕痹為主要證候。金成等[11]回顧分析的438例RA患者中，風寒濕痹證最多。王建等[12]通過多中心收集1019例RA患者病例資料，結論得出濕熱痹阻證占比最高，其次為寒濕痹阻證。根據對中醫經典理論的探討并結合臨床經驗，認為RA主要病機為風寒濕阻，治宜祛風散寒除濕，桂枝、附子、白術分別祛風、祛寒、祛濕，三藥相伍，契合祛風散寒除濕之法。

隨著中醫藥治療RA研究日益深入，越來越需要從多成分、多靶點、多途徑的角度解釋中醫藥發揮治療作用的機制。因此，本研究應用網絡藥理學探討桂枝、附子、白術治療RA的作用機制，為中藥現代化提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分和作用蛋白質靶點的篩選 分別以“桂枝”“附子”“白術”為關鍵詞在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)[13]進行檢索，設置篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.15，收集符合條件的活性成分和其作用的蛋白質靶點。OB代表到達全身循環的未給藥藥物的口服劑量百分比，DL是用于藥物設計的定性概念，是評價藥代動力學的重要參數。

1.2 蛋白質靶點名稱的標準化及“中藥-活性成分-靶點”的網絡構建 將1.1中收集到的靶點名稱分別輸入Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)[14]，設置限定條件為已驗證的人類基因，獲取靶點蛋白基因名的標準表達。將1.1項中中藥、活性化合物成分、蛋白質靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“中藥-活性成分-靶點”網絡圖，并分析網絡拓撲參數以獲取中藥治療的關鍵成分。

1.3 RA疾病相關基因的篩選 利用GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)和DisGeNet數據庫(https://www.disgenet.org)對RA的相關基因進行檢索，在2個數據庫分別輸入關鍵詞“rheumatoid arthritis”，設置種屬為“智人”，分別獲取疾病相關基因靶點。根據Relevance score值排序，若靶點信息過多，則選取大于中位數的靶點作為疾病的潛在靶點。因為Relevance score值表示該靶點與疾病聯系的緊密度，數值越高聯系越密切。收集到相關靶點信息后，合并2個數據庫結果，除去重復值，獲取最終預測的疾病靶點信息。

1.4 獲取中藥與疾病的共同靶點 將1.2和1.3中收集到的數據導入Excel工作表中，篩選中藥“桂枝、附子、白術”和RA的交集靶點，作為此組中藥干預RA的潛在作用靶點，交集結果通過韋恩圖展示。

1.5 蛋白互作網絡(PPI)構建 為了明確這組藥物靶點與疾病靶點的相互作用，將1.4中篩選出的交集靶點導入STRING 11.0 數據庫(https://string-db.org)[15]構建PPI。為確保可信度，選擇基于證據的網絡意義，將交互分數限定為>0.4，除去無相互作用的單一蛋白，利用 Cytoscape 3.7.2軟件將 PPI 網絡可視化，展示“桂枝、附子、白術”作用靶點蛋白與RA靶點蛋白之間的相互作用關系。

1.6 基因本體(GO)功能和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 應用Metascape數據平臺[16]分析“桂枝、附子、白術”治療RA相關靶點信號通路，把1.4篩選出的共同靶點基因導入該平臺進行GO和 KEGG 通路分析。GO富集分析包括分析生物功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular components，CC)，而KEGG 富集分析可以篩選“桂枝、附子、白術”治療RA的潛在作用信號通路。

1.7 分子對接驗證 從TCMSP數據庫搜索桂枝、附子、白術關鍵成分的結構，并保存為mol 2格式。分析1.5中網絡圖的度值，把相關參數排名前5的靶點作為核心靶點，查找其PDB ID，核心靶點的3D結構從 PDB 數據庫(http://www.rcsb.org/)下載，并使用Pymol軟件進行刪除蛋白結構的水分子和小分子配體等預處理。通過 AutoDock 軟件進行分子對接，先將靶點蛋白和小分子配體進行處理，轉換成pdbqt文件，然后用AutoDockTools對接并計算結合能，最后用Pymol 進行數據可視化。

2 結果

2.1 “桂枝、附子、白術”中藥活性成分和作用靶點的獲取 通過 TCMSP 檢索桂枝、附子、白術中符合條件的主要活性成分共20個，其中來自白術的7個，來自附子的6個，來自桂枝的8個，而谷甾醇為附子與桂枝共有成分，分別給各個活性成分做標記(見表1)。白術成分作用靶點19個、附子成分作用靶點18個、桂枝成分51個，合并后刪除重復值共得到靶點70個。

表1 中藥“桂枝、附子、白術”的主要活性成分

2.2 “中藥-活性成分-靶點”網絡的構建 將桂枝、附子、白術對應的20個活性成分、70個蛋白質靶點的相互關系導入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制“中藥-活性成分-靶點”網絡圖(見圖 1)。對該網絡進行拓撲分析，按連接度(Degree)排序，活性成分中GZ3為最大值38，其后依次為BZ6、GZ6、GZ4、FZ3，故預測以上5個成分為主要治療成分，并結合表1獲取成分的名稱，分別是β-谷甾醇(GZ3)、3β-白術乙酰基(BZ6)、花旗松素(GZ6)、兒茶素(GZ4)、德爾妥因(FZ3)。

圖1 中藥-活性成分-靶點網絡

2.3 RA疾病相關基因的篩選和中藥活性成分與疾病共同靶點的獲取 以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞在GeneCards數據庫中檢索獲取疾病靶點2238個，其中Relevancescore最大值為110.06，最小值為1.44，中位數為3.28，故設定Score>3.28的靶點為潛在靶點。結合DisGeNet數據庫補充相關靶點，合并后刪除重復值，最終得到1870個疾病相關靶點。通過分析得到中藥活性成分與RA疾病的共同靶點36個(見圖2)，這36個共同靶點作為“桂枝、附子、白術”治療RA的預測靶點。

圖2 中藥活性成分靶點與RA疾病靶點交集韋恩圖

2.4 PPI構建 將2.3中獲取的36個交集靶點導入STRING數據庫中進行分析，得到“桂枝、附子、白術”治療RA對應靶點的 PPI初步圖(見圖3)，刪去無相互關系的蛋白后，共涉及34個靶點。將生成的tsv文件導入 Cytoscape 3.7.2軟件，對所獲取PPI進行可視化處理(見圖4)。

圖3 STRING制作的PPI初步圖

圖4 Cytoscape可視化圖

Cytoscape 3.7.2網絡拓撲分析提示，該網絡節點的平均度值7.310，有13個大于平均度值，其中白細胞介素6(IL-6)(連接度為26，介度為 0.1287，緊密度為0.8048)，其次為腫瘤壞死因子(TNF)(連接度為24，介度為0.0867，緊密度為0.7674)、血管內皮生長因子A(VEGFA)(連接度為23，介度為0.0664，緊密度為0.7174)、IL-1β(連接度為21，介度為0.0446，緊密度為0.6875)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)(連接度為20，介度為0.0847，緊密度為0.6875)，故設定IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2為中藥“桂枝、附子、白術”治療RA的核心靶點。

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析 將36個交集靶點基因提交至Metascape數據庫進行信號通路分析，其中KEGG 富集顯示182條通路，剔除廣泛通路后共獲得34條信號通路，按-log10(P)值排序后繪制成高級氣泡圖(見圖5)。而GO功能富集分析結果顯示BP包含了982個GO術語條目，CC 40個，MF53個，按-log10(P)值排序后取排名前20個GO條目繪制成柱狀圖(見圖6)。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 排名前20的 GO功能富集分析

2.6 分子對接驗證 將2.4中篩選得到的核心靶點與“桂枝、附子、白術”的5個主要活性成分進行分子對接，其中最低結合能≤-5 kJ/mol表明藥物活性成分與核心靶點蛋白具有較好的結合作用。對接結果說明了“桂枝、附子、白術”中活性成分與 RA 中核心靶點有著良好的結合作用。其中TNF與β-谷甾醇結合力最好，PTGS2與花旗松素、IL-6與3β-白術乙酰基、IL-1β與花旗松素、TNF與德爾妥因對接也有較好的結合活性(見表2、圖7)。

圖7 桂枝、附子、白術主要活性成分與靶點對接的部分結果

表2 分子對接結果 kJ/mol

3 討論

本研究從“桂枝、附子、白術”中篩選得到20個活性成分和70個活性成分作用靶點。通過分析“中藥-活性成分-靶點”網絡，推測β-谷甾醇、3β-白術乙酰基、花旗松素、兒茶素和德爾妥因5個成分是“桂枝、附子、白術”治療RA的主要活性成分。相關研究表明，β-谷甾醇可調節巨噬細胞功能，可能是有希望的RA治療藥物[17]。花旗松素可減少促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，具有抗炎作用[18]，通過抑制核因子κB(NF-κB)信號通路抑制破骨細胞生成，對破骨細胞生成相關疾病如骨質疏松癥、骨溶解和RA具有治療潛力[19]。3β-白術乙酰基屬于白術內酯類成分，有研究顯示白術揮發油成分在抗炎、抗腫瘤方面有一定效果，能降低TNF-α、IL-1細胞因子水平[20]。相關動物實驗表明，兒茶素可能通過抑制滑膜細胞分泌前列腺E2(PGE2)、IL-1和TNF-α等環節降低關節炎大鼠關節滑膜細胞分泌功能[21]。德爾妥因相關研究較少，但本研究發現該分子能與較多RA靶點連接。分子對接驗證結果亦表明，這組中藥的主要成分與RA主要靶點的結合活性較強。通過PPI分析并構建相關網絡，篩選到IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2等36個核心靶點蛋白，這些蛋白共同參與調控RA的發展。IL-6、TNF、IL-1β等都是RA的經典靶點，PTGS2是前列腺素生物合成中的關鍵酶，已證實PTGS2在許多病理生理過程中具有重要作用，它的表達也與關節炎密切相關[22]。這些靶點參與了調節治療RA的眾多復雜通路。

GO功能富集結果提示，“桂枝、附子、白術”可能主要是通過促進成骨細胞分化、抑制凋亡、控制炎癥等途徑發揮對RA的治療作用。對34條KEGG信號通路進行分析，發現主要發揮了2類作用。①調控炎癥因子的水平：TNF信號通路(hsa04668)是富集得到的關鍵通路，已有研究表明TNF可通過級聯反應增加趨化因子的產生，從而促進炎癥因子的表達和釋放，在RA患者中加重炎性反應[23]。通過干預IL-17細胞信號通路(ko04657)可有效影響IL-17的分泌[24]，在RA患者滑膜中IL-17可與其他細胞因子協同促進炎性反應[25]。缺氧誘導因子1(HIF-1)可激活NLRP3的表達，而NLRP3參與了炎癥小體的組裝和IL-1β的加工[26]。②調控細胞周期：有研究認為，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路(hsa04151)參與滑膜細胞的增殖與凋亡調節，在RA滑膜細胞中處于異常激活狀態[27]，它的激活促使PI3K和Akt蛋白高表達，降低促凋亡蛋白的表達，抑制軟骨細胞的凋亡，從而減緩軟骨細胞的退變[28]。晚期糖基化終末產物(AGE)-晚期糖基化終末產物受體(RAGE)信號通路(ko04933)在RA的發生發展過程中起到重要作用，誘導細胞凋亡，促進新生血管生成。由此可見，“桂枝、附子、白術”對RA的治療作用可能是通過活性成分調控炎癥因子水平、調控細胞周期而實現。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學的方法，探究了“桂枝、附子、白術”治療RA的機制，同時采用分子對接方法對核心靶點與關鍵成分進行對接驗證。該組中藥可能是通過β-谷甾醇、3β-白術乙酰基、花旗松素等化合物成分調控IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2等疾病靶點，干預AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等炎癥經典通路，從調控炎癥因子水平和細胞周期方面發揮對RA的治療作用。這項研究有一些局限性，如在中藥劑量和水溶性等方面尚需進行深入探索，僅挖掘現有數據庫并預測了“桂枝、附子、白術”治療RA的藥理作用機制，然而其結果的可靠性和合理性尚需實驗進一步驗證。